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研究目的:IL-35是IL-12家族的新成员,是一种抑制性细胞因子,由IL-27β(EBI3)及IL-12α(p35)两个亚基所组成。IL-35可以将初始型T细胞诱导成一种新型的调节性 T 细胞即 IL-35 诱导的调节性 T 细胞(Interleukin-35 induced regulatory Tcells,iTR35),iTR35主要通过分泌细胞因子IL-35发挥免疫抑制效应,与已发现的通过IL-10和TGF-β发挥作用的调节性T细胞(regulatory Tcell,Treg)比较,抑制作用更强,持续时间更久,可以有效阻止炎症的发生、发展,是诱导感染性耐受的关键因子。在慢性乙肝患者外周血中IL-35含量明显增高,提示IL-35可能在HBV持续性感染的免疫致病机制中发挥作用,但IL-35对免疫系统抗HBV病毒过程的调控目前尚未明确。本文主要研究iTR35通过IL-35途径抑制HBV特异性细胞免疫应答的作用机制,并通过体外实验探讨IL-35对后续信号通路的激活作用,力求为治疗慢性乙型肝炎病毒提供新的策略与方案。研究方法:1.研究对象筛选2013年2月～2015年6月浙江大学医学院附属第一医院门诊及住院的慢性乙肝患者61例,均为未经抗病毒治疗患者。同时以42例健康人及21例慢性无症状HBV病毒携带者作为阴性对照。2.实验方法(1)采用Ficoll淋巴细胞分离液对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)进行分离;(2)CD4+及CD4-T淋巴细胞的分离采用免疫磁珠法;(3)分离后的CD4+T淋巴细胞经非特异性磁珠CD3/28刺激活化六天后用流式检测IL-35的两条蛋白链(EBI3及p35)在CD4+T淋巴细胞及CD4+CD25+细胞上的分布频率;用酶联免疫吸附法(ELISA)测定CD4+T淋巴细胞内IL-35的含量;(4)非特异性磁珠及特异性核心抗原结合不同浓度的IL-35刺激慢性乙肝患者CD4+T淋巴细胞24小时后流式检测CD4+T细胞表面因子(CD25、CD45RA、CD45RO)的分布频率变化;(5)非特异性磁珠结合不同浓度的IL-35刺激慢性乙型肝炎患者CD4+T细胞24小时后用ELISA法检测CD4+T淋巴细胞上清中的IL-10分泌量;(6)HBV核心抗原重要表达肽段(peptide 18-27)结合不同浓度的IL-35刺激慢性乙肝患者PBMC 11天后用MHC-肽五聚体(pentamer)流式细胞技术测定HB V抗原(主要针对HBV重要表位肽段core18-27)特异性CD8+CTL数量;(7)慢性乙肝患者CD4-T淋巴细胞经特异性抗原及不同浓度的IL-35刺激48小时后用酶联斑点免疫吸附法(ELISPOT)测定分泌IFN--γ细胞的数量;(8)慢乙肝患者贴壁细胞(ACs)经特异性抗原及不同浓度IL-35刺激24小时后收集细胞上清,用ELI SA法检测IL-6的分泌情况;(9)慢乙患者PBMC经特异性抗原及不同浓度IL-35刺激24小时后收集细胞,流式细胞技术检测树突状细胞(DCs)表面标志物:CD11c、CD86及HLA-DR;(10)CD4+T细胞经IL-35刺激后的STAT1～STAT4信号通路利用激光共聚焦定位;(11)利用流式检测IL-35刺激前后的转录因子STAT1～STAT4的含量变化判断STAT1～STAT4信号通路有无被激活;(12)采用速率法对血清ALT及AST水平进行测定;采用比色法检测血清总胆红素;血清中HBV五项标志物采用化学发光微粒子免疫分析(CMIA)技术检测;血清中HBV DNA采用实时荧光实时定量PCR分析方法测定,测定值小于1×103 copies/ml为阴性;(13)结果所得数据采用SPSS17.0统计软件包及GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析;研究结果:1、流式细胞术检测慢性乙肝患者及正常人外周血CD4+ T淋巴细胞及CD4+CD25+ Tregs中IL-35两条蛋白链EBI3及p35的含量:慢性乙肝患者CD4+ T细胞及Tregs中的EBI3表达含量较健康人均明显增高(P<0.001,P<0.001),ELISA法测得慢性乙肝患者外周血CD4+T细胞经刺激后IL-35含量较HBV携带者及正常人明显升高(P=0.041,P=0.004);2、流式结果显示EBI3在CD4+T细胞中的表达量与HBV DNA载量呈正相关(P=0.036,r=0.525),但与肝炎炎症指标如ALT、AST、TB等水平无关(P=0.275,r=0.291;P=0.378,r=0.236;P=0.336,r=0.257);3、HBV特异性核心抗原与不同浓度IL-35体外共刺激CD4+ T细胞可减少CD45RA在CD4+T细胞上的分布频率:Ag+PBS(对照组):36.09±5.93%;Ag+IL-35(10ng/ml):32.75±6.24%;Ag+IL-35(40ng/ml):33.50±5.41%;Ag+IL-35(100ng/ml):32.23±5.43%。对照组与加入IL-35各组间P值均小于 0.05;4、非特异性磁珠CD3/28刺激CD4+ T细胞后ELISA法检测CD4+ T细胞培养上清中的 IL-10分泌水平,CD3/28+PBS(对照组):128.3±36.5 ng/L;CD3/28+IL-35(10ng/ml):143.1±36.08 ng/L;CD3/28+IL-35(40ng/ml):155.5±36.14ng/L;CD3/28+IL-35(100ng/ml):160.8±32.75ng/L。对照组与加入IL-35组间P值均小于0.05;5、流式测HBV抗原特异性CD8+CTL五聚体(pentamer)分布频率,可见与对照组(peptide+PBS)相比peptide+IL-35(100ng/ml)体外刺激后pentamer在CD8+T细胞上分布频率明显降低(1.631±0.436vs1.019±0.269,P=0.003);IL-35(1 Ong/ml)、(40ng/ml)与组对照组相比,虽可见下降趋势,但统计结果无显著差异(P=0.673,P=0.446);6、ELISPOT法检测分泌IFN-γ的CTL数量:Ag+PBS(对照组):237±28,Ag+IL-35 SFU/well(10ng/ml):216±35 SFU/well;Ag+IL-35(40ng/ml):185±36SFU/well;Ag+IL-35(100ng/ml):170±36SFU/well。只加抗原组与IL-35(1Ong/ml)组相比未见明显差别,但与IL-35(40ng/ml、1OOng/ml)相比可见显著性差异(P=0.01,P=0007);7、ELISA法测ACs上清IL-6的分泌水平,两组表达IL-6浓度如下:Ag+PBS(对照组):375.9±101.9 pg/ml;Ag+IL-35(100ng/ml):313.0±99.23 pg/ml。两组间有统计学差异(P=0.002);8、流式检测DC细胞表面标志物,可见与对照组(Ag+PBS)相比,Ag+IL-35(1 00ng/ml)可抑制CD 11 c+细胞在PBMC中的分布频率,Ag+PBS(对照组):10.10±3.65%;Ag+IL-35(100ng/ml):8.96±3.40%。两组间有统计学差异(P=0.02);9、激光共聚焦可定位经过IL-35刺激培养后的CD4+T细胞胞浆高表达STAT1及STAT4蛋白;10、流式结果可见加入IL-35(100ng/ml)可以诱导转录因子STAT1、STAT4的上调,与未加IL-35组存在显著性差异(P=0.019,P=0.029)。研究结论:1、IL-35在慢性乙肝患者外周血中高表达,且与慢性乙肝的发生发展密切相关。2、IL-35不仅可以明显抑制HBV特异性CTL的增殖及其效应分子IFN-γ分泌,还可抑制CD4+CD25-CD45RA+效应T细胞及DCs的功能,并同时促进CD4+T细胞分泌免疫抑制因子,是影响慢性乙型肝炎发生发展的关键因素。3、IL-35可以激活CD4+T细胞上的STAT1/STAT4信号通路,预示IL-35极有可能通过JAK/STAT通路抑制HBV效应性T细胞增殖与分化。