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目的:
慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是起源于多能造血干细胞的恶性肿瘤性疾病,其自然病程可分为慢性期(CP)、加速期(AP)和急变期(BC)。研究表明,80%的病人在CML-BC可见到除ph染色体外的其它染色体异常。P16基因定位于人染色体9p21,P16的功能失活可导致CDK的过度作用促进细胞非正常繁殖,与人类多种肿瘤的发生、发展、恶化密切相关;UBAP1基因是一个新的泛肽相关蛋白家族成员。研究表明,与相应的正常组织比较,其在癌变组织中表达不一,说明UBAP1基因可能与多种肿瘤的发生发展密切相关[2],但UBAP1基因在血液病研究中尚未见报道。P16基因和UBAP1基因二者位于9p21~22的相邻区域,均参与细胞周期的调节过程,能够延缓细胞由G0、G1期进入S期,从而起到调控细胞生长的作用。
因此,本课题主要研究调控细胞生长的肿瘤抑制基因P16和UBAP1在慢性粒细胞性白血病细胞中的mRNA表达水平,并探讨二基因与疾病发展的关系。
方法:
一、选取研究对象
93例初诊CML,患者骨髓标本,其中CML-CP76例,CML-AP及CML-BC17例,其中12粒为急髓变,5粒为急淋变。非恶性血液病患者22例作为对照组。
二、实时荧光定量PCR
收集患者骨髓单个核细胞,提取总RNA,按试剂盒说明书配置逆转录反应体系合成cDNA,引物由Takara公司设计合成,采用SYBRGreenⅠ实时定量荧光PCR方法,以GAPDH为内参照,进行SYRB GreenⅠ实时荧光定量PCR,检测P16及UBAP1的表达水平。
三、结果判断
根据实时荧光定量PCR得到Ct值,通过标准曲线计算得出P16、UBAP1及GAPDH基因的拷贝数,通过P16、UBAP1与内参基因GAPDH的拷贝数比值算出P16及UBAP1的相对表达水平。
四、统计学分析
采用SPSS16.0软件进行分析,实验结果应用秩和检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
一、方法的可靠性和准确性
1、RNA的纯度和质量分析
所提取的总RNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8-2.0之间,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,条带清晰可见,无明显降解。
2、扩增的特异性及定量的准确性
标准品cDNA经梯度稀释后进行PCR反应,制作标准曲线。得到的标准曲线相关系数(r2)均>0.998,斜率在-3.3至-3.5之间,反映定量准确,扩增效率良好。扩增后溶解曲线显示锐利的单一锋,无其他非特异性锋,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。
二、P16、UBAP1基因在CML中的表达
在慢性粒细胞白血病慢性期中P16基因mRNA的表达水平与对照组比较无显著性差异(p>0.05),在加速期和急变期中,急髓变时P16基因的表达无明显变化,而在急淋变患者中观察到表达的明显下调(p<0.05);在慢性粒细胞白血病慢性期中,UBAP1基因mRNA的表达水平与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。然而,在CML,加速期和急变期,UBAP1基因出现明显下调,与正常对照组比较有显著性差异(p<0.05)。
结论:
UBAP1基因与P16基因的低表达可能同时参与慢性粒细胞白血病急变的发病,他们之间既有独立的影响,彼此之间又相互联系,使CML中某一克隆出现恶性增殖,导致CML急变。