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草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是联合国粮食及农业组织发布的全球警报中的重要迁徙害虫之一。它于2019年初首次入侵我国云南省,并迅速扩散到了全国多个省份,对我国玉米等多种经济作物造成严重威胁。相比传统的化学杀虫剂带来的环境及抗药性等问题,杆状病毒作为一种昆虫特异性微生物杀虫剂,表现出更强的优势,并被用于防控多种农业害虫。在昆虫抗病毒免疫中,microRNA（miRNA）发挥了举足轻重的作用。杆状病毒感染宿主昆虫后引起宿主细胞内多种miRNA的表达变化。为了明确草地贪夜蛾编码的miRNA在调控杆状病毒复制过程中的调控作用及分子机制,我们通过高通量测序分析了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）的感染对宿主编码的miRNA表达谱的影响。同时,我们分析了AcMNPV的感染对宿主细胞miRNA合成通路的影响。在差异表达的miRNA中筛选出调控AcMNPV感染的miRNA,即microRNA-34-5p（miR-34-5p）。随后,经过体外转染miR-34-5p模拟物/抑制剂、构建过表达miR-34-5p重组杆粒等方法明确了miR-34-5p对AcMNPV增殖的调控功能。利用双荧光素酶实验证实了miR-34-5p靶向AcMNPV的靶基因,即odv-e66、ac78和ie2,揭示了miR-34-5p抑制AcMNPV复制的分子机制。本研究内容分为四部分,获得的主要结果如下:一、microRNA合成途径参与草地贪夜蛾Sf9细胞昆虫宿主的抗病毒反应首先,通过高通量测序技术对未感染和经AcMNPV-EGFP感染的Sf9细胞进行s RNA测序,经分析共到91种known miRNA和104种novel miRNA;在AcMNPV-EGFP感染后的Sf9细胞中共得到49个差异表达的miRNA,其中差异极显著的有10种;同时,我们选择了17种差异表达miRNA进行RT-qPCR验证,结果显示除miR-278-3p外,其他miRNA的差异表达趋势均与测序相同;同时,预测差异表达极显著的miRNA的靶基因,并对它们进行GO和KEGG通路分析,分析表明这些潜在靶基因在多种通路中承担重要功能。其次,用RT-qPCR的方法检测了AcMNPV-EGFP感染Sf9细胞前后miRNA合成通路中的关键基因Dicer-1、Argonaute1、Exportin-5和Ran的转录水平,结果显示AcMNPV-EGFP感染Sf9细胞后,Exportin-5、Dicer-1和Argonaute1的m RNA水平持续增加,表明microRNA合成途径参与草地贪夜蛾Sf9细胞昆虫宿主的抗病毒反应。二、miR-34-5p通过调控AcMNPV子代病毒增殖和宿主细胞的能量代谢来参与抗病毒感染首先,体外转染miRNA mimic和inhibitor至Sf9细胞,采用TCID50终点稀释法分析了miR-11-3p、miR-2a-3p、miR-34-5p、miR-92a-3p和miR-278-3p对AcMNPV BV滴度的影响,结果显示miR-34-5p mimic组的lg(TCID50/m L)值显著降低,miR-34-5p抑制AcMNPV子代病毒的增殖。其次,分析了miR-11-3p、miR-2a-3p、miR-34-5p、miR-92a-3p和miR-278-3p对AcMNPV感染后宿主细胞能量代谢的影响,结果显示,miR-11-3p提升了AcMNPV感染后宿主细胞的能量代谢水平;miR-2a-3p抑制AcMNPV感染后宿主细胞的能量代谢;miR-92a-3p和miR-278-3p对Sf9细胞的能量代谢无影响;miR-34-5p抑制AcMNPV感染后宿主细胞的能量代谢。第三,用RT-qPCR的方法检测AcMNPV感染Sf9细胞12、24、48、72 h时miR-34-5p的表达,结果显示miR-34-5p的表达在12和72 h p.t.时下降了50%,在24和48 h p.t.时分别下降70%和80%;用绝对定量PCR检测AcMNPV感染细胞72 h后病毒和宿主DNA的复制情况,结果显示,miR-34-5p抑制了病毒DNA的复制,而促进宿主DNA的复制。第四,我们将4个pre-miR-34串联排列构建了重组杆粒Bacmid-4×pre-miR-34-EGFP,将Bacmid-4×pre-miR-34-EGFP转染至Sf9细胞12～72 h后miR-34-5p的表达量升高至mock组的10.5、13.4、7.9和7.1倍。第五,用TCID50终点稀释法检测Bacmid-4×pre-miR-34-EGFP对AcMNPV子代病毒增殖的影响,结果表明Bacmid-4×pre-miR-34-EGFP抑制AcMNPV子代病毒的增殖。同时,Bacmid-4×pre-miR-34-EGFP抑制了AcMNPV DNA的复制及促进宿主DNA的复制,并抑制宿主细胞对葡萄糖的利用。三、miR-34-5p靶向AcMNPV相关基因的预测和验证首先,使用miRanda软件、RNA22 v2及RNAhybrid在线网站对AcMNPV编码基因的CDS区进行miR-34-5p的靶位点预测,共预测到17个潜在靶基因。其次,miR-34-5p与11个潜在靶基因的相互作用经双荧光素酶实验验证,结果显示odv-e66、ac78和ie2是miR-34-5p的靶基因。最后,用RT-qPCR方法检测AcMNPV编码基因的转录水平,结果表明过表达miR-34-5p后抑制了odv-e66、ac78、ie2、gp64、lef3、vp80、ac132的转录水平,而miR-34-5p inhibitor的处理上调了这些基因的转录水平,这表明miR-34-5p靶向odv-e66、ac78和ie2基因是通过抑制它们的m RNA水平实现的。四、miR-34-5p对AcMNPV感染草地贪夜蛾活性的影响首先,采用RT-qPCR的方法检测了miR-34-5p在草地贪夜蛾不同龄期幼虫中的表达情况,及其在AcMNPV-EGFP感染后的表达变化,结果显示miR-34-5p的表达随着幼虫龄期的增加而降低,而在AcMNPV-EGFP感染期间,二、三和四龄幼虫中miR-34-5p的表达显著降低。其次,测定了AcMNPV-EGFP和AcMNPV-4×pre-miR-34-EGFP对草地贪夜蛾四龄幼虫的LD50和LT50值,结果显示AcMNPV-EGFP和AcMNPV-4×pre-miR-34-EGFP的LD50值分别为4.4×10~7和6.9×10~8 vp/larva,后者的LD50值是前者的15.68倍;而两种病毒的LT50值无明显差异。最后,分析了AcMNPV-4×pre-miR-34-EGFP对草地贪夜蛾幼虫化蛹和羽化的影响,结果显示,在2.8×10~8、2.8×10~9和2.8×1010vp/larva的注射剂量下,AcMNPV-4×pre-miR-34-EGFP组的化蛹率高于AcMNPV-EGFP组;在2.8×10~4和2.8×10~5 vp/larva的注射剂量下,AcMNPV-4×pre-miR-34-EGFP组的羽化率低于AcMNPV-EGFP组。这些结果表明,miR-34-5p的过表达抑制AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫的抗虫活性,并影响幼虫的化蛹和羽化。综上所述,本研究通过高通量测序分析了AcMNPV感染对Sf9细胞miRNA表达谱的影响,并鉴定出49种差异表达的miRNA。随后,从差异表达的miRNA中筛选出调控AcMNPV子代病毒增殖的miR-34-5p,探究了miR-34-5p调控AcMNPV子代病毒增殖的分子机制,明确了miR-34-5p的三个病毒靶基因odv-e66、ac78和ie2,并在虫体水平上分析了miR-34-5p对AcMNPV抗虫活性的影响,明确了miR-34-5p的过表达降低了AcMNPV的抗虫活性。本研究寻找到一种昆虫-杆状病毒相互作用的调节者,证明了miR-34-5p对AcMNPV子代病毒增殖的直接调控作用,为昆虫抗病毒免疫提供了坚实的理论基础;同时,也为RNAi应用于害虫防控提供了依据,对鳞翅目害虫的绿色防控具有重要意义。