论文部分内容阅读
MADS-box基因家族编码真核生物中参与多种重要生物过程的转录因子。该基因家族广泛存在于酵母,植物,昆虫,线虫,无脊椎动物和哺乳动物等多种真核生物中。在植物中,至今已经发现数百个MADS-box基因家族成员,裸子植物、被子植物,蕨类植物和苔藓植物中均有分离和克隆。研究表明在被子植物中,MADS-box基因家族不仅参与花发育的过程,还参与了如生长点的确定、春化过程、果实成熟、根系的发育、种胚的发育等多种重要发育的调控过程。本文采用电子克隆,3RACE等方法克隆到42个MADS-box基因,分别命名为TaAGL1到TaAGL42,其中38个具有ORF结构。试验中还利用RT-PCR方法对其表达模式进行了分析。为了深入了解小麦MADS-box基因TaAG7和TaAG1的生物学功能,还进行了转化拟南芥的研究,以期深入了解其在小麦生长发育过程中的作用。所得结果如下:
1、利用生物信息学技术对GenBank数据库中现有的小麦EST序列进行了全面分析,从中获得了42个MADS-box基因,其中38个ORF结构。对这些基因的氨基酸序列进行分析,发现它们都具有典型MADS-box基因保守区域。并通过与拟南芥和水稻MADS-box基因相比较,发现一个可能为单子叶植物新的特有OsMADS32亚族。
2、采用半定量RT-PCR方法系统的检测了49个小麦MADS-box基因在不同时期、不同组织器官中的表达情况。研究发现授粉后6天和12天种子中,34个不同的MADS-box基因均检测到表达信号,而在萌发过程中的种胚31个MADS-box基因存在不同程度的表达,在营养生长期TaAGL1,TaAGL3,TaAGL4,TaAGL7,TaAGL11,TaAGL13,TaAGL33,TaAGL40和WPI1等9个基因持续表达,而TaVRV-A1,TaAGL7和TaVRN-2则在生殖生长期持续表达。值得一提的是TaAGL7,TaAGL29在成熟的干种子中存在预存的mRNA。显示出在不同的生育期,不同的组织器官中都有多个不同MADS-box基因家族成员同时作用,调节植物体的正常生长发育。
3、以强优势组合小麦3338,2463及其杂交种拔节期的叶片、茎、根系为材料,采用半定量RT-PCR方法检测了所获得基因的表达情况,结果表明它们在小麦杂交种与亲本之间存在明显的表达差异,并且差异表达模式因基因类型和所检测的组织器官不同而变化。
4、采用mRNA原位杂交的方法检测了5个小麦MADS-box基因在根尖,抽穗期穗下节和小穗的表达。结果显示TaAGL1,TaAGL7,TaAGL11在根系中根冠,分生组织区的表皮细胞表达,而TaAGL6则在根系伸长区的中柱鞘细胞和表皮细胞中表达更丰富。TaAGL7,TaAGL11在抽穗期穗下节表达部位的集中在维管束、韧皮细胞。在抽穗期小穗中TaAGL1,TaAGL7,TaAGL11,TaAGL29都有表达,但TaAGL11主要集中在心皮组织中,而TaAGL1,TaAGL7,TaAGL29则颍壳、外稃、浆片、内稃以及雄蕊和心皮组织中都有大量表达。
5、将TaAGL7超量表达转化拟南芥,对转基因株系进行表型鉴定,发现与野生型和空载体对照相比整株表现株高增高,花期延长,多数种荚表现空瘪败育,但偶有正常种荚。对花器的观察表明:花萼,花瓣以及雌蕊明显大于野生型植株,电镜扫描结果显示花瓣的细胞明显增大。雄蕊发育正常,花粉染色正常,电镜扫描结果显示花粉发育正常。雌蕊发育速度过快,在开花前已经伸出花苞,切片显示柱头部位细胞发育异常,这可能就是造成不育的重要原因。
6、将TaAGL11超量表达转化拟南芥,对转基因株系进行表型鉴定,发现整株表现株高增高,花期延长,种荚短小。对花器官的观察表明:花萼,花瓣,雄蕊以及雌蕊与野生型植株没有明显区别。但花粉染色显示转基因植株表现出花粉粘连的现象,同时,电镜扫描结果显示花粉发育异常多数干瘪,推测花粉育性可能受到影响。