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目的Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是Bcl-2家族BHS-only亚家族的成员，是一种重要的凋亡调节蛋白。Bim广泛表达于正常细胞，其中包括造血细胞，上皮细胞，神经细胞以及生殖细胞。PI3K／Akt信号通路参与调节细胞凋亡、增生、分化和代谢等一系列生理活动，现有许多研究表明PI3K／Akt信号通路异常，与肿瘤的发生发展关系密切。研究证实，不同的生长因子刺激后，PKB／Akt磷酸化forkhead家族转录因子，改变其胞内定位。在没有PKB／Akt作用的情况下，forkhead家族主要定位于核内，通过结合到特异顺式作用元件促进Fas-L、IGFBP1和Bim等凋亡相关基因的转录。近有报道，在Ba／F3细胞，激活的Akt可以直接磷酸化BimEL的Ser87位点，促进其的泛素化和降解。本科研组的前期工作发现，PI3K-Akt-Bad通路在乳腺癌的发生发展过程中有重要作用，Bim、Bad同属于BH3-only亚家族，那么在乳腺癌的发生发展中，Bim是否扮演着同样重要的角色，这对指导乳腺癌的临床诊断和治疗有重要意义。材料和方法1、材料（1）临床资料：101例乳腺组织取自中国医科大学附属第一临床医院，为2001-2005年手术切除标本。依据WHO乳腺肿瘤组织学分类标准（2003）进行组织学分级，其中乳腺正常组织15例，普通导管增生病变组织12例，乳腺导管轻中度不典型增生病变组织10例，重度不典型增生及导管原位癌病变组织17例，乳腺浸润性导管癌病变组织47例。（2）细胞系：人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞系购自协和医科大学细胞中心。细胞分别在37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培养液中培养，待细胞铺满瓶底时弃去培养液，0.25％胰蛋白酶消化传代。2、试剂第一抗体分别为兔抗人Bim多克隆抗体（购买自Neomarkers公司）和兔抗人p-Akt1／2／3（Ser473）多克隆抗体（购自Santa Cruz公司）。PI3K／Akt特异性抑制剂LY294002购自Cell Signaling公司。免疫组化染色过程采用的即用型S-P试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。Western Blotting用二抗及兔抗人多克隆anti-β-actin抗体（PR-0255）均购自中山生物技术有限公司。DMEM及RPMI 1640培养基购自购自Gibco公司。3、方法（1）免疫组化（S-P）法：①步骤：按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）法试剂盒说明书步骤行免疫组织化学染色。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。②结果判定：以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为Bim表达阳性细胞。镜下选择10个高倍视野的1000个肿瘤细胞，根据阳性细胞的百分率分为四个等级：0分无阳性细胞；1分阳性细胞＞30％；2分阳性细胞30％～70％；3分阳性细胞＞70％。按染色强度将其也分为个等级：0分无阳性细胞；1分阳性细胞染色呈浅黄色；2分阳性细胞染色呈黄色；3分阳性细胞染色呈棕黄色。阳性细胞数评分与染色强度评分相加后除以2得出综合评分。综合评分≥2分为阳性表达。（2） Western印迹法：待细胞至90％融合状态时，冰冷的PBS冲洗细胞两次，加入0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞。在收集的细胞内加入裂解液反复吹打，4℃静置30min，离心提取上清为总蛋白。不同终浓度的LY294002（0、10、25、50μmol／L）处理MCF-7细胞24h后，按上述方法提蛋白，用Bradford法测蛋白浓度。以每孔80μg蛋白入10％SDS-PAGE凝胶电泳后，4℃、50V下湿式电转移仪将蛋白质转入PVDF膜。5％脱脂奶粉封闭液封闭2h，一抗[抗Bim（1：200），抗p-Akt（1：300）]稀释，4℃孵育膜过夜，相应二抗（1：1500）室温孵育膜2h，DAB显色，观察拍照，进行灰度值测定。实验重复3次以上。4、统计学分析应用SPSS11.5统计分析软件进行分析，P＜0.05有统计学意义。结果1、Bim蛋白在各组病变中的表达。免疫组化结果显示，Bim蛋白在乳腺导管内增生性病变及浸润性导管癌组织中阳性表达率逐渐降低，在乳腺普通导管增生与重度不典型增生及原位癌组间、重度不典型增生及原位癌和浸润性导管癌组间阳性表达率差异均具有统计学意义（P=0.026；P=0.014）。2、乳腺癌组织中Bim表达与临床病理特征间的关系。在47例乳腺浸润性导管癌中，Bim蛋白表达与患者的临床分期、淋巴结转移无明显关系，但与组织学分级有关（P=0.033），且组织学分级越低，Bim蛋白阳性表达率越低。3．Bim蛋白在乳腺癌细胞中的表达。Western印迹法检测结果显示，低转移的MCF-7细胞中Bim蛋白的表达高于高转移的MDA-MB-231细胞。4、用LY294002阻断PI3K／Akt信号通路后乳腺癌细胞Bim蛋白表达的变化。将不同浓度的LY294002（0、10、25、50μmol／L）加入培养液后24h，用Western印迹法检测显示，乳腺癌细胞MCF-7中p-Akt蛋白水平下降，Bim蛋白表达水平升高。讨论Bcl-2蛋白家族是调节细胞凋亡的关键元件，它是调控线粒体和凋亡因子释放的主要调节因子。Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是Bcl-2家族中BH3-only亚家族成员，是一种重要的凋亡调节蛋白。Bim蛋白在多种正常细胞中均有表达，其中包括造血细胞、上皮细胞、神经细胞以及生殖细胞。Bim蛋白的促凋亡活性受到严格的调控，包括转录水平和翻译后修饰的调节。Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生，其中多为造血系统肿瘤，从而强有力地证明Bim是一种肿瘤抑制因子。本研究发现，Bim蛋白在乳腺导管内增生性病变及浸润性导管癌组织中阳性表达率逐渐降低，在乳腺普通导管增生与重度不典型增生及原位癌组间、重度不典型增生及原位癌和浸润性导管癌组间阳性表达率差异均具有统计学意义（P=0.026；P=0.014）。低度恶性的MCF-7细胞中Bim蛋白的表达高于高度恶性的MDA-MB-231细胞。这提示Bim蛋白的变化可能在乳腺癌的发生发展过程中有一定的作用。本科研组的前期工作发现，随着乳腺导管增生程度的加重和癌变，p-Akt的表达阳性率和表达强度都明显增高，为明确在乳腺癌中Bim的表达变化是否跟PI3K／Akt通路的改变有关，我们进一步在体外研究了乳腺癌细胞中PI3K／Akt信号通路与Bim蛋白表达的关系。随着LY294002浓度升高，p-Akt蛋白表达水平降低，Bim蛋白表达水平逐渐升高，提示在乳腺癌细胞中，Bim蛋白表达可能通过PI3K／Akt信号通路来调控。我们的结果显示Bim蛋白表达的改变可能与乳腺癌的发生发展有关，且提示PI3K／Akt信号途径在乳腺癌癌变过程中有重要作用。目前以细胞信号传导分子为靶点的PI3K／Akt信号传导通路抑制剂成为肿瘤治疗的新靶点，我们的实验结果可为PI3K／Akt信号通路作为乳腺癌治疗的靶点提供理论依据。结论1、Bim蛋白在正常乳腺导管、乳腺导管上皮内瘤变及乳腺癌中的表达呈递减趋势。2、Bim蛋白的表达与乳腺癌组织学分级有关，组织学分化程度越低，蛋白阳性表达率越低。3、在乳腺癌细胞MCF-7中，LY294002阻断PI3K／Akt通路，使p-Akt表达水平下降，Bim表达水平升高。