皮下软组织充填是整形外科常见的治疗手段。对于体表的皮下软组织缺损，凹陷萎缩畸形目前常采用自体游离脂肪或各种人工材料进行充填。人工材料因存在排异反应及安全性问题难以满足临床需要，而自体游离脂肪的移植存活率低。脂肪移植物被吸收的原因总结起来可分为两种：一是成熟脂肪细胞对缺氧损伤的耐受力低，且不容易增殖更新；其二是由于移植脂肪组织的血供不足，导致移植到供区的脂肪因缺氧而坏死，产生硬结液化。以干细胞为种子细胞，应用组织工程的方法构建脂肪组织，已成为目前人们研究的热点。现在应用较多的是骨髓间充质干细胞，但由于其取材困难，来源有限而受到一定限制。最近人们从脂肪组织中分离提取出具有干细胞作用的一种细胞类型，称为脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)，它具有取材便利、创伤小，不会引起伦理学争议等优点，成为应用前景广泛的一种可用于自体组织修复和重建的种子细胞。　　 除了种子细胞外，寻找一种适合脂肪组织工程的支架材料也是一项挑战。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由生物大分子构成的错综复杂的网络。在体内为细胞的生存及活动提供适宜的环境，并通过与细胞黏附分子、调节因子和连接蛋白等一系列与细胞生存、发育和代谢相关的细胞因子的相互作用，影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。ECM支架材料的种属差异小，抗原性较弱，移植后不易产生排斥反应。将脱细胞ECM移植于组织缺损区后，可为细胞提供适宜其生存的三维空间和促进移植物新生血管化的建立，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换并排除废物，并且可作为自体细胞生长框架，诱导自体细胞长入其内。ECM支架的组织来源有：小肠粘膜下基质、血管、皮肤、神经、骨骼肌和膀胱等。而研究较多的是猪小肠来源的小肠粘膜下层(smallintestinal submucosa，SIS)。SIS是天然细胞外基质类生物衍生材料，主要成分为Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维，还含有多种生长因子，如FGF-2、TGF-β和VEGF等。SIS免疫原性低，有抗微生物活性，有良好的细胞相容性，可促进多种细胞在材料上的黏附、生长和分化。SIS植入宿主体内后，能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主细胞的长入与分化，由此产生的再生组织在结构和功能上均与原位组织相似。目前，SIS主要用于血管、肌腱、韧带、骨膜和膀胱等组织的修复。　　 作为组织工程的支架材料，ECM具有良好的生物相容性和可降解性，但目前该支架材料主要来源是动物或人尸体，这就容易产生免疫原性问题和病原菌传播的危险。脂肪组织是遍布人体的一种结缔组织，具有能量储存、缓冲作用、绝缘作用等独特的功能。脂肪组织主要由充满脂滴的脂肪细胞组成，还有其它的细胞成分包括：成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、血细胞和脂肪源性干细胞。除此以外，在脂肪组织中还有重要的ECM成分，如胶原、网状纤维、弹性纤维、神经纤维、血管基质和淋巴结等物质，以及含有内分泌功能的细胞因子。最近有研究证实将脂肪组织通过不同的脱细胞方法制备成的三维支架，不仅保留了大部分细胞外基质成分，而且可以促进ASCs的粘附、增殖和成脂分化。既ECM构建了一种有利于干细胞活化的微环境，以保证干细胞的再生功能。由于脂肪组织具有来源丰富，只需通过吸脂术等简单的手术即可获得，安全性高，更重要的是不存在免疫排斥反应和伦理学问题。　　 本实验分别用猪小肠和人脂肪抽吸术后的脂肪组织，制备两种不同来源的ECM支架，制备成粉末状，分别构建SIS和AT-ECM微粒支架。观察两种材料的脱细胞洁净度和形态结构。从脂肪抽吸术后的脂肪组织中提取分离脂肪源性干细胞，经体外扩增培养后，从细胞生长动力学、形态学、增殖分化能力和表面标记物等诸多方面探究其生物学特性。将人的ASCs与两种微粒支架材料体外复合后，观察种子细胞在两种材料上的粘附和生长情况。并将与细胞复合后的SIS和AT-ECM微粒支架注射到裸鼠体内，比较两种材料对ASCs粘附、增殖和成脂分化能力的影响。以期为再生医学和组织工程器官替代物，尤其是脂肪组织工程器官生物产品提供一种功能更有效使用更方便的器官移植的人工支架材料。　　 一、材料　　 材料与方法　　 (一)组织材料　　 人脂肪组织来自8例行腹部脂肪抽吸术的健康成年女性患者，年龄24-47岁，平均35.13±7.62岁，无传染病和内分泌疾病。　　 (二)实验动物　　 裸鼠购自北京维通利华实验动物技术中心，猪小肠空肠段来自沈阳市肉联加工厂　　 (三)实验材料　　 低糖DMEM、胎牛血清(Gibco)，Ⅰ型胶原酶、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、β-甘油磷酸钠、油红O(Sigma)，CD31-FITC、CD45-FITC、CD34-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD49d-PE、CD106-PE单克隆抗体(eBioscience)，细胞周期检测试剂盒(凯基生物)，Real time PCR试剂盒(TaKaRa)。　　 二、方法　　 (一)人脂肪源性干细胞的分离、培养与鉴定　　 将吸脂术后脂肪组织用胶原酶消化法，分离培养脂肪源性干细胞。相差显微镜观察细胞形态，MTT法测定P3、P9、P15、P20代的细胞生长活性；流式细胞仪测定细胞周期和表面抗原表达；成脂成骨诱导后分别行油红O和茜素红染色定性。　　 (二)两种细胞外基质微粒支架(SIS，AT-ECM)的制备特性及体外相容性观察　　 取猪小肠的空肠段，用物理方法和化学方法制备SIS，取吸脂术后的脂肪组织用酶消化法和机械方法制备AT-ECM，组织学染色和扫描电镜观察其结构及脱细胞情况；将两种材料制备成粉术状后与ASCs进行复合，用MTT和扫描电镜方法观察两种微粒支架与种子细胞的相容性。　　 (三)两种细胞外基质微粒支架(SIS，AT-ECM)体内成脂分化观察和比较　　 将脂肪源性干细胞与SIS、AT-ECM微粒支架材料体外复合，注射入裸鼠背部皮下，以不与基质微粒支架材料复合的单纯ASCs植入做为对照，分别于注射后4周和8周时取出，行HE染色、油红O染色和Real time PCR技术检测细胞在两种材料中的成脂分化结果，并进行比较。　　 结果　　 一、人脂肪源性干细胞的生物学特性　　 人脂肪源性干细胞在形态上类似成纤维细胞，呈漩涡状生长；MTT检测结果显示分离培养的ASCs传至15代仍有较强的增殖活性，之后逐渐减慢，至20代时细胞增殖速度明显降低；细胞周期分析发现ASCs具有干细胞的特性；流式细胞仪检测结果显示间充质干细胞标记CD90、CD44表达阳性，造血干细胞标记CD34、血细胞标记CD45、内皮细胞标记CD31表达均为阴性，另外，CD49d低表达，CD106表达阴性；成脂诱导后细胞内可见大量脂滴形成，油红O染色阳性；成骨诱导后镜下可见钙结节形成，茜素红染色阳性。　　 二、SIS和AT-ECM微粒支架的结构和体外相容性结果　　 两种材料冻干粉碎后呈粉末状，HE染色未见蓝染的细胞核及残留的细胞或细胞碎片。Masson染色显示脱细胞后的主要成分为胶原纤维，还有少量的肌纤维。扫描电镜观察两种支架材料主要由胶原纤维构成的网状结构，SIS网格状结构更为完整；ASCs与两种材料的体外复合实验说明SIS和AT-ECM微粒支架都能促进种子细胞的粘附和生长，但后者作用更明显。　　 三、ASCs在两种微粒支架上的体内成脂分化结果　　 两种不同的支架材料体内植入4周和8周取材，各组都有肉眼可见的新生组织形成，大体观察呈黄色，柔软，接近人体脂肪组织，新生组织湿重统计分析各组间无显著性差异(P>0.05)。HE染色可见脂肪细胞形成，胞内有较大脂滴，细胞核偏于一侧，细胞间可见疏松结缔组织分隔。但是只有AT-ECM组发现其具有血管成分，油红O染色阳性，8周时较为明显。SIS组油红O染色弱阳性，而ASCs组则为阴性。Real time PCR检测结果显示AT-ECM组中成脂分化相关基因PPARγ2、LPL和Leptin呈高表达，有统计学意义(P<0.05)。　　 结论　　 人脂肪抽吸物经酶消化法能分离出具有成纤维细胞形态的干细胞，在体外培养条件下能保持稳定的增殖，表达脂肪间充质干细胞相关的表面抗原，在诱导因子的作用下能向脂肪细胞和成骨细胞分化。　　 应用物理和化学方法能成功的对猪空肠进行脱细胞处理，制备SIS微粒支架，它是一种主要由胶原纤维组成的三维网状结构。应用机械方法和酶消化方法对人脂肪组织进行脱细胞处理有效，制备成功的AT-ECM微粒支架在形态学上与SIS相似，也是由胶原纤维组成的网状结构。与ASCs复合培养结果表明：AT-ECM和SIS都能促进细胞的粘附增殖，前者的作用更明显。　　 裸鼠体内实验结果显示虽然AT-ECM和SIS微粒支架都能促进ASCs的成脂分化，但前者的诱导血管化程度更高，成脂分化相关基因的相对表达量也高于SIS和ASCs组，其新生组织更接近于人体内的脂肪组织；因此，来自人脂肪组织的AT-ECM微粒支架更适合ASCs的体内成脂分化。