【摘 要】
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研究目的1.探究circSADM4A在钙化的人主动脉内皮细胞（HAEC）中的差异表达;2.探究circSamd4a在钙化的小鼠主动脉血管的差异表达;3.验证circSADM4A在冠状动脉钙化（CAC）患者的血浆标本中的差异表达及其作为标志物的诊断效能。研究方法1.建立β甘油磷酸+L-抗坏血酸+地塞米松诱导的HAEC钙化模型:钙化组HAEC以30 mmol/Lβ甘油磷酸+50μg/ml L-抗坏血酸
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研究目的1.探究circSADM4A在钙化的人主动脉内皮细胞（HAEC）中的差异表达;2.探究circSamd4a在钙化的小鼠主动脉血管的差异表达;3.验证circSADM4A在冠状动脉钙化（CAC）患者的血浆标本中的差异表达及其作为标志物的诊断效能。研究方法1.建立β甘油磷酸+L-抗坏血酸+地塞米松诱导的HAEC钙化模型:钙化组HAEC以30 mmol/Lβ甘油磷酸+50μg/ml L-抗坏血酸+100 nmol/L地塞米松诱导14 d,Western blot检测钙化标志蛋白,q PCR检测钙化相关基因水平,CCK-8检测细胞活力,茜素红S染色检测钙盐沉积。2.q PCR检测circSADM4A在两组中的差异表达。3.建立小鼠主动脉血管钙化模型:小鼠普通饲料先适应性喂养2周,将预先混好的尼古丁加花生油对小鼠灌胃,9h后再次灌胃,之后将维生素D3和无水乙醇混合的溶液对小鼠进行肌肉注射,辅以高脂饮食,构建小鼠主动脉钙化模型;对照组小鼠仅用花生油灌胃,并且以无水乙醇肌肉注射,辅以普通饮食;造模期间小鼠自由饮水饮食,每日观测小鼠状态并记录,保持恒定的温度、湿度,光照适宜。小鼠生长到实验设定周数解剖,提取主动脉血管。以Von Kossa染色、Western blot、q PCR方法从不同层面验证模型建立成功与否。4.qPCR检测circ Samd4a在对照组和小鼠主动脉血管钙化模型中的差异表达。5.通过冠状动脉CTA检查筛选出冠状动脉发生钙化的患者以及冠脉无病变对照人群并计算钙化积分（CACS）,同时收集血浆标本:应用q PCR分别检测发生冠状动脉钙化和无钙化患者血浆样本的circSADM4A表达水平,以CACS来区分对照组和钙化组,CACS为0分设为对照组,CACS大于等于100分设为钙化组。同时分析血浆差异表达circSADM4A与CACS之间的相关关系。6.使用ROC曲线来评价血浆circSADM4A表达水平对CAC的诊断效能。研究结果1.建立HAEC钙化模型:经过多次重复试验,Western blot的结果显示,BMP2、BMP4的蛋白表达水平和对照组相比显著上调;q PCR的结果显示,BMP2、BMP4的基因表达水平较对照组上调（P＜0.05）;CCK-8检测钙化组细胞活力显著下降（P＜0.05）;茜素红S染色观察到钙化组HAEC中沉着的钙盐,表明HAEC钙化诱导成功。2.在上述成功建立的钙化的HAEC中检测circSADM4A水平,q PCR结果显示:和对照组相比,circSADM4A在钙化组中显著下调（P＜0.05）。3.建立小鼠主动脉血管钙化模型:小鼠主动脉组织Western blot结果示诱导钙化小鼠BMP2、BMP4钙化标志蛋白升高明显;q PCR结果也表明BMP2、BMP4表达水平升高（P＜0.05）;Von Kossa显示,诱导钙化小鼠的血管能看到明显的钙盐沉积,并且肌丝断裂明显。4.在上述小鼠模型中检测circ Samd4a水平,q PCR结果显示:和对照组相比,circ Samd4a在钙化小鼠主动脉组织中显著下调（P＜0.05）。5.q PCR结果显示,和冠状动脉无钙化患者相比,发生冠脉钙化的患者血浆中circSADM4A表达水平显著下降（P＜0.05）,差异有统计学意义;并且血浆差异表达的circSADM4A与CACS之间存在显著负相关关系。6.受试者工作曲线（ROC曲线）显示,血浆circSADM4A表达水平对CAC的诊断效能为（AUC:0.81;95%CI:0.707–0.913;P＜0.001）。研究结论1.当HAEC发生钙化时,circSAMD4A呈显著下降趋势,circSADM4A可成为治疗VC的一个潜在干预靶点;2.当小鼠主动脉血管发生钙化时,circ Samd4a也呈明显的下降趋势;3.CircSAMD4A可以作为CAC的标志物,并且有较好的诊断效能。
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