受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein3，RIP3)是程序性坏死的关键性调控因子。在程序性坏死复合物中，RIP3可与其同家族成员RIPl通过同型相互作用结构域(RHIM)相互结合，并且可通过自身的激酶结构域与混合型激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain like protein，MLKL)相互结合并将其磷酸化，介导程序性坏死的下游信号。RIP3已经被证实与多种疾病有关，如急性胰腺炎、酒精性肝损伤、动脉粥样硬化等，提示RIP3的抑制剂具有潜在的临床治疗价值。　　目前，已报道RIP3抑制剂很少，且尚没有使用RIP3小分子抑制剂进行疾病治疗的研究报道。原因之一可能是目前没有不使用放射性同位素、可进行高通量筛选的RIP3抑制剂分子水平筛选模型。本课题的目的是发现RIP3抑制剂并研究其对RIP3介导的、程序性坏死相关的、醋氨酚诱导的肝损伤的保护作用。为此，我们建立了系统的RIP3抑制剂的发现和评价体系，包括使用分子、细胞模型进行抑制剂的发现以及靶点验证。利用上述体系，我们发现B-RafV600E抑制剂dabrafenib在分子和细胞水平都具有很强的RIP3抑制活性。　　我们采用Bac-to-BacTM昆虫杆状病毒表达系统表达全长的RIP3，优化酶、反应底物MBP、ATP等的浓度以及反应所需的温度、反应时间，建立了基于ATP消耗法的RIP3抑制剂筛选模型。反应条件为:在10μl的反应体系中，含50活性单位的RIP3、25 ng/μl底物MBP、10μM ATP，在30℃反应90分钟。　　B-RafV600E抑制剂是一类用于治疗转移性黑色素瘤的重要抗癌药物。基于B-Raf蛋白与RIP1构象的相似性和RIP3与RIP1蛋白序列的相似性，我们用上述筛选模型评价了一系列B-Raf抑制剂。我们发现6个B-Raf抑制剂能够在分子水平抑制RIP3激酶活性，其中以dabrafenib的抑制活性最强。该结果进一步为由美国Reaction Biology公司用放射性同位素法独立评价所得的数据证实，既确认了我们的结果，也证明了我们所建立非放射性同位素模型方法的可靠性和准确性。　　在RIP蛋白家族成员中，dabrafenib对RIP3具有高度的选择性抑制作用;对RIP3的抑制活性是RIP1的53200倍，RIP5的29350倍，RIP2的77倍。采用表面等离子共振法(SPR)证实，dabrafenib与RIP3蛋白发生直接的相互结合，结合动力学常数为26.5 nM。ATP竞争实验和分子对接实验(molecular docking)表明，dabrafenib是一个ATP竞争性的RIP3抑制剂，可以竞争结合于RIP3的ATP结合位点。在分子水平能够抑制RIP3酶活性的6种B-Raf抑制剂中，只有dabrafenib能够有效抑制TNF-α/Trail/FasL+Smac mimetic+Z-VAD-fmk诱导的RIP3依赖的程序性坏死的发生，并且在HT29细胞和U937细胞中抑制TNF-α+Smacmimetic+Z-VAD-fmk(TSZ)诱导的程序性坏死的程度与RIP1抑制剂necrostatin-1相当。此外，dabrafenib能够有效阻断RIP3介导的程序性坏死下游信号通路，如减少TSZ引起的MLKL第358位丝氨酸的磷酸化、阻断RIP3与MLKL形成蛋白复合物。我们还证明了dabrafenib的RIP3抑制活性与其B-Raf抑制活性相互独立。　　为阐明dabrafenib对RIP3介导的程序性坏死相关疾病的潜在治疗/预防价值，我们采用了醋氨酚诱导肝损伤的细胞模型和动物模型。采用人正常肝细胞的研究表明，dabrafenib能够浓度依赖的缓解对醋氨酚诱导的早期肝细胞坏死，并且这种缓解作用依赖其RIP3抑制活性。小鼠体内实验结果表明，采用灌胃给药的方式(100mg/kg及300 mg/kg)，提前于醋氨酚给药(300 mg/kg)1小时的情况下，dabrafenib能够剂量依赖地防止肝损伤导致的血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高;300 mg/kg的dabrafenib还可以有效降低血浆IL-1β和TNF-α以及肝组织氧化型谷胱甘肽的升高。上述作用是依赖于dabrafenib的RIP3抑制活性。H&E染色和Tunel染色结果进一步显示，dabrafenib能够剂量依赖性地减轻醋氨酚诱导的小鼠肝组织损伤和肝细胞坏死。　　以上结果表明，B-RafV600E抑制剂dabrafenib是高选择性RIP3抑制剂，能够有效缓解醋氨酚所致的肝损伤。该发现不仅为进一步研究RIP3生物学功能提供了一种重要工具，而且还显示dabrafenib在治疗或者预防RIP3相关的程序性坏死导致的疾病中具有潜在的临床价值。