阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)的两大重要的病理学特征是神经细胞内的大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和神经细胞间的大量老年斑(senile plaques，SP)。神经原纤维缠结主要由异常过度磷酸化的骨架蛋白tau构成，而老年斑的核心成分是由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)降解产生的β-淀粉样多肽（β-amyloid，Aβ）。对于AD发病机制也就相应地存在着“tau异常学说”和“Aβ毒性学说”，但孤立地用一种学说不能充分、全面地解释AD脑中的病理改变。因此，寻求异常过度磷酸化修饰的tau蛋白以及Aβ之间的联系及其机制逐渐成为AD研究的热点。　　第一部分 糖原合酶激酶-3在β-淀粉样多肽诱导的tau蛋白过度磷酸化中的作用及其机制　　体内外实验发现，外源性给予Aβ处理可以引起tau蛋白的过度磷酸化，而GSK-3和cdk5可能参与这一过程。在这些研究中所用的Aβ浓度远远高于正常脑中的含量，而且AD患者脑中Aβ的增高是一个慢性过程，那么这些外源性给予大剂量Aβ处理得到的结果是否适用于AD患者？因此，我们将野生型和瑞典型突变的APP转染到N2a细胞中，并筛选稳定表达细胞株，观察不同的Aβ生成量对tau蛋白磷酸化的影响并探讨其机制。结果如下:　　1.转染细胞株中Aβ生成增多、tau蛋白发生过度磷酸化　　我们首先检测了筛选出的APP稳定转染细胞中的APP的表达情况。N2a/APPwt和N2a/APPswe细胞中APP的表达量明显高于空白质粒转染组(N2a/vector)。培养基中Aβ的量用ELISA方法检测，结果显示:与N2a/vector细胞相比，N2a/APPwt细胞培养基中分泌的Aβ40和Aβ42分别增高了1.4倍和1.1倍;而N2a/APPswe细胞分泌到胞外的Aβ40和Aβ42增高更明显，分别为2.6倍和2.0倍。转染细胞中APP高水平的表达以及分泌到胞外Aβ的增加均表明转染成功，而且转染的APP能在细胞中正常表达和代谢。　　用识别总tau的111e、识别非磷酸化Ser198/199/202位点的tau-1以及识别磷酸化Ser396/404位点的PHF-1进行免疫印迹检测三种细胞中的tau蛋白的磷酸化，结果显示:与N2a/vector细胞相比，N2a/APPwt和N2a/APPswe细胞中111e和tau-1的免疫反应无明显改变，但PHF-1的免疫反应分别增加了41％和78％,表明APP转染细胞中的tau蛋白在Ser396/404位点的磷酸化明显增强，并且以N2a/APPswe细胞增加更显著。　　2.APP转染细胞中GSK-3和cdk-5活性的变化　　为阐明转染细胞中tau蛋白过度磷酸化的机制，我们检测了GSK-3和cdk-5的酶活性。GSK-3体外直接酶活性测定结果显示:与N2a/vector相比，N2a/APPwt、N2a/APPswe细胞中GSK-3的活性分别增高37％和64％。免疫沉淀法测定cdk5的酶活性发现:N2a/APPwt和N2a/APPswe细胞中cdk5的活性不升高，反而分别下降了40％和50％，但cdk-5的总蛋白水平并未改变。这些结果提示，是GSK-3而不是cdk-5导致了APP转染细胞中的tau蛋白的过度磷酸化。　　3.GSK-3和cdk-5抑制剂对APP转染细胞tau蛋白磷酸化的作用　　为确定GSK-3和cdk-5在APP转染细胞中tau蛋白过度磷酸化中的作用，我们分别用二者的抑制剂LiCl和roscovitine处理细胞。结果显示:LiCl可明显抑制tau蛋白在Ser198/199/202(tau-1)和Ser396/404(PHF-1)位点的磷酸化，而5μM和10μM roscovitine则不能抑制tau蛋白在上述位点的磷酸化。由于20μMroscovitine明显降低细胞活性，故roscovitine的终末浓度只用到10μM。这一结果进一步确定了是GSK-3而不是cdk-5导致了APP转染细胞中的tau蛋白的过度磷酸化。　　4.GSK-3和cdk-5抑制剂对APP转染细胞Aβ生成的作用　　为确定GSK-3和cdk-5在Aβ生成中的作用，我们分别用LiCl和roscovitine处理细胞后检测Aβ的水平。结果显示:GSK-3的抑制剂LiCl处理N2a/APPswe细胞24 h后，培养基中的分泌性Aβ40和Aβ42减少。然而，5μM和10μM roscovitine对培养基中的分泌性Aβ40和Aβ42无明显影响。LiCl和roscovitine对细胞中APP的蛋白表达水平无明显影响。提示GSK-3参与了APP转染细胞中Aβ的过量生成。　　结论：　　内源性Aβ过量生成激活GSK-3从而导致tau蛋白在Ser396/404位点过度磷酸化;PKC的活性下降是Aβ介导的GSK-3激活的机制之一;GSK-3的抑制剂(LiCl)不仅降低APP转染细胞中tau蛋白的异常磷酸化，而且使Aβ的生成减少;cdk5的抑制剂(roscovitine)不能降低APP转染细胞中tau蛋白的异常磷酸化，也不能减少Aβ的生成。因此，GSK-3在Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化中起关键作用。　　第二部分 Aβ使细胞对凋亡敏感性增加的机制以及tau蛋白的抗凋亡作用　　Aβ的细胞毒性作用，包括Aβ引起的细胞凋亡，一直是AD研究的热点之一。曲于在AD患者的脑中存在着Aβ、氧化应激等凋亡诱导因素，并检测到一些凋亡的改变，因此凋亡一度被认为是AD患者脑中神经元死亡的方式。凋亡在16-24h即可完成，而AD是一个慢性疾病，如果神经元受到凋亡信号的刺激后发生凋亡，那么大量的神经元就会迅速丢失，脑组织结构必将严重毁损，相关的症状在短时间内即可出现，这与AD的实际情况显然不符。“凋亡流产”概念的提出则可以合理地解释上述矛盾，即在AD脑中凋亡被启动，但未能进行到底。那么，什么因素阻抑了凋亡的级联反应?tau作为胞内积聚蛋白的主要成分是否参与这一过程？我们首先观察了内源性Aβ生成增加使细胞对凋亡更易感的机制，然后观察瞬时转染tau能否减轻N2a/APPswe细胞的凋亡。　　1.N2a/APPswe细胞对H2O2诱导的凋亡的敏感性增加　　250μM H2O2处理后，N2a/vector和N2a/APPswe细胞均表现出时间依赖性的细胞活性下降，并且N2a/APPswe细胞的变化较N2a/vector更明显。Hoechst33258核染色显示:H2O2处理后的细胞明显表现出染色质浓缩、边集、DNA片段化等凋亡的核形态特征，N2a/APPswe细胞中凋亡细胞（38±7％）明显高于N2a/vector对照组（25±5％），表明N2a/APPswe细胞对H2O2诱导的凋亡的敏感性增加。　　2.H2O2诱导的caspase-3活性增高及PARP的裂解　　未处理组细胞中caspase-3的活性很低，而且N2a/vector和N2a/APPswe细胞中的基础caspase-3的活性无差异。H2O2诱导凋亡后，N2a/vector和N2a/APPswe细胞中easpase-3的活性呈时间依赖性增强，且以N2a/APPswe细胞的变化更显著。N2a/APPswe细胞在H2O2处理3h后即可检测到PARP的裂解片段，而N2a/vector细胞中PARP的裂解片段在H2O2处理6h后才出现。对同一时间点(6、9、12h)而言，两种细胞内PARP的裂解片段的量存在显著性差异。这些结果表明N2a/APPswe细胞中caspase-3活性的增高更显著。　　3.H2O2诱导的凋亡相关基因表达的改变　　为研究细胞凋亡的机制，我们检测了一些凋亡相关蛋白的变化。N2a/APPswe细胞的Bax、p53基础水平显著高于N2a/vector,而Bcl-2的基础水平基本一致。H2O2诱导凋亡后，N2a/vector和N2a/APPswe细胞的Bax、释放入胞浆的Cyt c均明显增高，同时Bcl-2的蛋白水平显著降低，并以N2a/APPswe细胞的变化更显著。H2O2处理后，N2a/vector细胞的p53蛋白水平呈时间依赖性增高，而N2a/APPswe细胞p53却无明显增高。但是，H2O2处理12h以内，对照组N2a/vector的p53虽有增高，但仍低于N2a/APPswe细胞的基础p53水平，只有处理12h时才达到与N2a/APPswe细胞相近的基础水平。N2a/APPswe细胞较高的Bax、p53基础状态打破了细胞内促凋亡与抗凋亡机制的平衡，使细胞对凋亡刺激更敏感，而胞内的高p53基础水平可能使凋亡刺激难以引起更明显的增高。　　结论：　　本研究发现Aβ生成增加使N2a/APPswe细胞p53、Bax基础水平增高，从而使细胞对H2O2诱导的凋亡易感性增加;胞内tau蛋白的积聚可以减弱H2O2诱导的N2a/APPswe细胞的凋亡。