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幽门螺杆菌感染调控胃癌相关基因可变剪接的初步研究目的收集胃癌癌旁新鲜组织,分离培养cagA基因阳性幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)。使用液体培养基对H. pylori进行摇菌,获取H. pylori培养滤液。使用cagA基因阳性H. pylori培养滤液诱导胃黏膜上皮GES—1细胞恶性转化,使其出现肿瘤化特征。提取转化细胞总RNA,利用基因特异引物反转录结合巢式PCR技术,筛选H. pylor滤液诱导GES-1细胞恶性转化过程中发生的异常剪接事件。旨在从可变剪接视角探讨H. pylori致胃癌发生的分子机制。方法随机选择18例H. pylori阳性胃窦癌患者,取癌旁5 cm处活检组织标本,采用哥伦比亚琼脂培养基分离培养H.pylori。采用PCR方法筛选出cag A基因阳性H. pylori,取其中一阳性菌株,液体振荡摇菌,制备cagA基因阳性H. pylori培养滤液。选择人永生化胃黏膜细胞系GES-1为受试对象,分别以5%(v/v)和10%(v/v) cag A基因阳性H. pylori滤液浓度梯度诱导GES-1细胞恶性转化。通过观察细胞形态、细胞生长情况及克隆集落形成能力,判断转化后GES-1的肿瘤化特征。使用RNA试剂盒提取GES—1及转化后GES—1细胞总RNA。利用基因特异引物反转录结合巢式PCR技术鉴定CD44基因剪接变体。结果18例H. pylori阳性胃窦癌患者中,9例成功分离培养出H. pylori,分离培养成功率为50%。采用PCR方法检测9株菌的cagA基因,阳性率为100%。选取一株cagA基因阳性菌,液体摇菌,当菌液OD值为1-1.5之间时,提取滤液。cagA基因阳性H. pylori培养滤液诱导GES—1细胞恶性转化后,细胞有以下特征：(1)形态学改变：细胞出现多形性,核形态不规则,细胞核增大、畸形、多核仁、核分裂相；(2)细胞生长曲线：随着H.pylori培养滤液浓度的增加和作用时间的延长,生长曲线上升逐渐明显,且呈量效-时效正相关；(3)软琼脂培养基中的集落生长：以不同浓度梯度H. pylori培养滤液处理GES-1,5%(v/v) H. pylori滤液处理组克隆形成率45%,10%(v/v) H. pylori滤液处理组克隆形成率55%5%(v/v) H. pylori滤液处理组克隆形成率与对照组(克隆形成率30%)相比有统计学差异(P<0.05),10%(v/v)H.pylori滤液处理组与对照组相比显著升高(P<0.01)。克隆形成集落的大小,数目随H. pylori培养滤液浓度的增加而增加。收集cagA基因阳性H. pylori培养滤液转化后的GES—1细胞,提取总RNA,采用巢式PCR技术鉴定CD44基因,研究发现cagA基因阳性H. pylori培养滤液诱导GES—1恶性转化后出现了CD44基因剪接差异。结论从胃癌患者的癌旁组织中成功分离培养出9株cagA基因阳性H. pylori。使用cagA基因阳性的H. pylori培养滤液成功诱导GES—1细胞出现肿瘤化特征。利用基因特异引物反转录结合巢式PCR技术鉴定了CD44基因剪接变体,发现H. pylori诱导GES—1细胞恶性转化过程中发生了CD44基因的差异表达,CD44基因异常剪接事件可能是H. pylori致胃癌发生的重要分子机制,为深入研究胃癌发生的分子机制提供了新的思路。