论文部分内容阅读
草甘膦（N-（膦羧基曱基）甘氨酸）是一种非选择性、广谱、内吸收传导的茎叶处理除草剂,由于其具有广谱、低毒、安全、无土壤残留的特点,一直被认为是迄今为止最优秀的除草剂,特别是随着转基因抗草甘膦作物的大面积商业化,草甘膦已经成为使用量最大的品种,占整个除草剂市场的20%以上。因为草甘膦具有独特的作用方式及代谢机制,具有灭生性特点,人们一度认为在田间不可能出现抗草甘膦杂草。然而,严酷的事实是,近10年来,已经在数个国家和地区发现了 32种抗草甘膦杂草。而且,也存在天然耐性的植物种类。这给草甘膦持续使用的安全性带来巨大威胁。因此,检测监测杂草的抗药性和耐药性,深入研究其机制,对保障除草剂技术安全,农业的可持续发展均有重要的意义。因此,本文对高耐草甘膦的3种麦冬草的耐性水平进行生物学评价,并进一步对其分子机制进行研究;在此基础上,采用易错PCR的方法对土麦冬EPPS进行定向改造;此外,还系统分析已有抗/耐性植物EPSPS基因的结构特点。为抗/耐性杂草管理提供理论依据,为发掘新抗草甘膦基因提供更广泛的资源。主要研究结果分述如下:1.麦冬草对草甘膦的耐药性生物测定草甘膦虽然是一种灭生性除草剂,但是,陆续发现了自然界天然耐性的植物。麦冬、土麦冬和阔叶土麦冬就是高耐性的植物种类。本文通过耐药性生物测定明确麦冬、土麦冬和阔叶土麦冬的ED50值分别为7000、7360和8230 g ae ha-1,约为一般大田用量的5倍,是迄今报道的最高植物对草甘膦天然耐药性;在3000 g ae ha-1草甘膦浓度处理下,发现3种麦冬草体内莽草酸的积累量与对照并无显著差异,这暗示草甘膦未对它们体内的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（EPSPS）引起抑制效应;麦冬草在叶表皮的气孔密度、形态结构上存在差异,可能是导致它们3者ED50值差异的原因之一。2.麦冬草草甘膦耐性分子机制研究为了明确是否是靶标基因EPSP合成酶基因的变异导致其耐性产生,运用RT-PCR结合RACE技术,克隆EPSPS基因,经序列分析发现,麦冬草存在三处特异的氨基酸,分别是71Met、112Ile和201Met。土麦冬EPSPS的IC50值为14.OμμM,显著高于野生型拟南芥的5.1μM,土麦冬EPSPS的Km值（4.27μM）明显高于拟南芥EPSPS（2.58μM）,Ki（草甘膦）值（1.91μM）也显著高于拟南芥EPSPS（1.08μM）。原核表达分析发现,土麦冬EPSPS基因在大肠杆菌中得到了高效表达,草甘膦处理,重组菌株的EC50值为9080 mg/L,显著高于对照菌株的6838mg/L;通过根癌农杆菌介导法将土麦冬EPSPS基因转入野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）,对转基因拟南芥愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因拟南芥对草甘膦的耐受性提高3.6倍。Southern杂交显示麦冬、土麦冬和阔叶土麦冬EPSPS基因的拷贝数分别为2、2、3。荧光定量结果表明,麦冬、土麦冬和阔叶土麦冬在1500 gae/ha草甘膦处理下EPSPS基因的表达量与对照相比都出现了显著的升高,分别为对照的17、43和99倍,显著高于野生型拟南芥。由此,麦冬、土麦冬和阔叶土麦冬的EPSPS基因结构差异,基因多拷贝以及高表达量是决定其天然耐性的主要机制。3.基于易错PCR技术的土麦冬EPSPS基因的定向进化研究在将独特结构的土麦冬EPSPS转入大肠杆菌E.coli和拟南芥中,虽能够显著增强对草甘膦的抗性,但是这个抗性水平还不足以商业化应用。因此,我们采用易错PCR的方法对土麦冬EPSPS基因进行定向改造。经高浓度草甘膦筛选,获得一个高抗草甘膦的突变基因,含有5个突变位点（37Val、67Asn、277Ser、351Gly和422Gly）。在大肠杆菌中原核表达LSE-EPSPS基因,能够赋予大肠杆菌对草甘膦的更高的耐受性;通过根癌农杆菌介导法将LSE-EPSPS基因转入野生型拟南芥,其ED50值为1844 mg/L,约为野生型拟南芥的5.45倍（338 mg/L）,转LS-EPSPS基因拟南芥的2倍（899mg/L）。此基因可能为抗草甘膦农作物的研究提供一个拥有自主知识产权的基因来源。4.抗/耐草甘膦植物EPSP合酶基因的结构分析EPSP合酶作为草甘膦的靶标其突变会影响其亲和性导致对草甘膦的抗/耐性,系统分析植物的EPSP合酶氨基酸组成及其基因序列,对于阐明草甘膦抗/耐性分子机制及新抗性基因发掘具有重要理论意义。本文通过克隆的10种和收集已有的101种植物EPSP合酶及其基因的信息,系统分析了与植物抗/耐性的关系。发现其中的杂草对草甘膦抗性水平ED50为300～4000 ae g/ha,而耐草甘膦杂草的ED50为787～8229 ae g/ha。根据EPSPS基因序列聚类分析结果可以将111种植物分为单子叶、双子叶和其他植物3组。植物的EPSPS保守区预测得到了 15个保守的结构域,其中的11个是非专利保护的,CD2、CD5、CD9、CD10、CD11和CD12为首次认定的保守区,进一步还明确了其它高度保守氨基酸位点。结合抗/耐性植物EPSPS分析发现其中高频率的氨基酸突变都位于保守区1、3、4和6等4个结构阈中,存在的突变为Ile29Thr、Phe96Ser、Gly101Ala、Thr102Ala、Pro106Ala/Leu/Ser/Thr、Met128Ile、Gly134Glu、Lys141Gln、Gly144Asp/Asn、Thr183Ala/Ser、Ala188Thr 以及 Asp351Gly。同一位点不同突变的EPSP合酶活性的影响不同,在黑麦草EPSSP合酶106位的4种突变中,Pro106Ala和Pro106Ser突变对EPSPS中1O1Gly和草甘膦之间氢键的变化相似,与敏感型比较都延长了 0.14 A,Pro106Thr的氢键则延长0.15 A,Pro106 Leu造成的氢键变化最大达0.24 A。除了上述保守区的氨基酸突变外,本文还发现土麦冬（易错突变后）和薤白EPSPS中同时存在保守区和非保守区的突变,土麦冬EPSPS中存在CD12的Asp351Gly和非保守区的Glu37Val和Arg422Gly突变;薤白中存在CD6的Gly175Asp和非保守区Ala415Ser变异。可能这两类突变共同作用,赋予其草甘膦耐性。但是,3种麦冬草以及乌蔹莓的耐草甘膦EPSPS基因的氨基酸替代只发生在非保守区,麦冬草EPSPS中存在Ala112Ile和Va1201Met以及91Glu的缺失,乌蔹莓EPSPS中存在Ser229Ala和Glu390Val替代。更进一步对非保守区突变的乌蔹莓EPSPS结构进行分析发现,与敏感型糙果苋EPSPS相比,131Arg和草甘膦之间的氢键距离缩短了 0.1A。所以,在EPSP合酶中,除了保守区的突变,不处于活性中心的非保守区的突变也会导致与底物的结合能力改变产生对草甘膦的抗性/耐性。这个结果为草甘膦抗性分子机制研究和基因资源的挖掘提供一个新的理论依据。