一、缩氨基硫脲类新化合物TSC020502的抗肿瘤作用及其分子机制研究　　 临床用于治疗铁超载疾病的铁螯合剂去铁敏(DFO)经体内外和临床实验证明，能够有效并选择性地抑制肿瘤细胞增殖。DFO极差的透膜性限制了其作为抗肿瘤药物的应用，因此一系列以抗肿瘤为出发点的更有效的铁螯合剂应运而生。　　 我们评价了一系列具有全新结构的缩氨基硫脲类化合物的抗肿瘤活性，其中化合物TSC020502显示出最强的活性。本课题旨在评价TSC020502的体内外抗肿瘤活性，并对其作用机制进行深入探讨。　　 采用四氮唑盐(MTT)还原法和磺基罗丹明B(SRB)蛋白染色法，我们发现TSC020502对20株不同组织来源的肿瘤细胞均具有明显的生长抑制作用，表现出较强的抗肿瘤细胞增殖活性(IC50：0.002～0.829μM)。同时，通过测定TSC020502对三株多药耐药肿瘤细胞(K562/A02、KB/VCR和MCF7/ADR)及其亲本细胞的增殖抑制作用，证实该化合物具有良好的抗多药耐药作用。值得注意的是，较之亲本细胞，TSC020502能更显著地抑制多药耐药肿瘤细胞的生长。在体内，TSC020502能够显著地抑制小鼠S-180肉瘤、人结肠癌HT-29和人横纹肌肉瘤Rh30裸小鼠移植瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用。　　 我们运用COMPARE分析比较缩氨基硫脲类化合物和其他化合物在NCI的60株人肿瘤细胞上的抗肿瘤谱，发现这类化合物与拓扑酶抑制剂VP16的抗肿瘤谱具有良好的相关性，提示两者的作用机制可能相似。相应地，我们利用pBR322解旋反应和kDNA去连环试验发现TSC020502能够显著抑制TopoII活性，而对TopoI活性没有明显的抑制作用。进一步实验表明，TSC020502能够将周期同步化的HT-29细胞阻滞在G2/M期，提示该化合物对TopoII的抑制作用导致细胞在有丝分裂时染色单体无法分离，继而引起细胞周期在G2/M期的阻滞。其他的铁螯合剂如DFO和3-AP均对TopoII的催化活性没有影响，说明TSC020502对TopoII活性的抑制并不源于其铁离子螯合作用。　　 根据作用机制的不同，TopoII抑制剂被分为催化抑制剂和毒剂两类。其中毒剂通过捕获并稳定TopoII和DNA的可切割复合物，造成DNA损伤；而催化抑制剂则通过作用于其它的一些步骤影响TopoII活性，因此可以克服毒剂诱导细胞产生的非典型耐药。TSC020502对TopoII低表达的HL60/MX2细胞的增殖抑制活性略强于HL60细胞，提示其不是TopoII毒剂，可能是催化抑制剂。通过TopoII介导的DNA切割实验发现，TSC020502并不能诱导TopoII-DNA可切割复合物的形成，相反可以抑制VP16捕获并稳定TopoII-DNA可切割复合物。此外，通过彗星实验和测定H2AX的磷酸化水平评价细胞内DNA的损伤情况，我们发现TSC020502不能引起肿瘤细胞的DNA断裂，但是可以抑制VP16引起的DNA损伤。以上结果均提示TSC020502是一个全新结构的TopoII催化抑制剂。　　 由于TopoII催化抑制剂的作用方式各异，我们进一步探索了TSC020502对TopoII催化循环中具体环节的影响。通过TopoI介导的DNA伸展实验和EB替代分析，我们发现TSC020502既不能嵌入DNA也不能和DNA小沟结合。凝胶迁移实验的结果表明，TSC020502不能阻碍TopoII和DNA的结合。同时，TSC020502也不能抑制TopoII引起的DNA切割。但是TSC020502可以剂量依赖性地有效抑制TopoII的ATPase结构域(HsATPase)的ATP水解作用。通过SPR技术测定TSC020502和HsATPase的结合动力学过程，我们发现TSC020502可以和HsATPase特异性地结合，并且结合力强于ATP。相应地，增加反应体系中的ATP浓度可以显著削弱TSC020502对HsATPase水解活性的抑制。这些结果说明TSC020502对TopoII活性的抑制作用是通过竞争性地干扰ATP与TopoIIATPase结构域的结合，从而抑制其ATP水解作用，使TopoII不能改变构象，无法进入下一轮催化反应循环。　　 综上所述，本研究发现缩氨基硫脲类新化合物TSC020502具有较强的体内外抗肿瘤和抗多药耐药活性。TSC020502能够螯合细胞内的铁离子，使DNA合成受阻，细胞周期阻滞在S期初期。同时作为TopoII的DNA非嵌入型催化抑制剂，TSC020502能与ATP竞争性地结合在TopoII的ATPase结构域，抑制其ATP水解作用，阻止TopoII的循环再利用，从而引起同步化细胞发生G2/M期阻滞。这两种作用机制既相互独立，又相辅相成，共同赋予了TSC020502良好的抗肿瘤活性。因此，作为一个新结构的缩氨基硫脲类化合物，TSC020502独特的双重作用机制将为同类化合物和TopoII抑制剂的发现和开发提供崭新的思路。　　 二、ADAM15蛋白抑制肿瘤转移及其机理研究　　 ADAMs(A Disintegrin And Metalloproteinase)是一类具有多个功能结构域和多种功能的跨膜糖蛋白，在许多生理和病理过程中发挥了重要作用。　　 为了揭示ADAM15的功能并阐明其中的机理，我们从人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中克隆ADAM15的全长基因，并将此基因转染入CHO细胞，构建了稳定高表达ADAM15基因的CHO细胞株(CHO/ADAM15)。CHO/ADAM15细胞与对照细胞相比，增殖能力没有发生显著变化。但是在ADAM15过表达之后，细胞在纤粘蛋白上的粘附能力显著提高，并且可以被α5siRNA所逆转，提示CHO/ADAM15细胞在纤粘蛋白上的粘附是由α5β1介导的。相应地，CHO/ADAM15细胞周边形成更多的粘着斑，肌动蛋白聚集形成更有序的丝状应力纤维结构。迁移需要适当的粘附，过强或过弱的粘附都会导致迁移能力的下降。无论是用transwell小室检测细胞对纤粘蛋白的趋向运动能力，还是用愈痕实验检测细胞在纤粘蛋白上的水平运动能力，CHO/ADAM15细胞的两种运动能力都发生了显著减弱。用siRNA下调α5的表达，CHO/ADAM15的迁移能力进一步下降，提示ADAM15的过表达使α5β1介导的细胞迁移能力得到了削弱。　　 迁移和粘附是肿瘤转移中的关键环节，所以ADAM15对细胞粘附和迁移能力的改变可能会影响肿瘤转移。我们用逆转录病毒体系在黑色素瘤B16F10细胞中过表达了ADAM15蛋白(B16F10/ADAM15)。将对照和过表达细胞株通过尾静脉注射入小鼠，17天后解剖小鼠，发现B16F10/ADAM15细胞形成的肺转移灶数目明显比对照细胞形成的少，表明ADAM15在体内能显著抑制肿瘤的转移。　　 进一步用流式细胞术检测α5β1在细胞表面的表达水平，我们发现在ADAM15过表达之后，α5β1在细胞表面的分布增加，其中α5亚基增加，而β1亚基不变。用siRNA特异性地下调ADAM15表达，α5亚基在细胞表面富集的现象得到逆转，而β1亚基的分布依旧保持不变。用免疫荧光染色检测α5的分布，发现α5在CHO/ADAM15细胞表面呈簇状分布，表明其活化程度增加。同时，α5的基因和蛋白水平随着ADAM15表达的变化没有发生任何改变。因此，ADAM15不能在转录或翻译水平影响α5的表达，但改变α5的分布和活化程度。　　 通过免疫荧光染色和免疫共沉淀，我们并没有在CHO细胞中观察到ADAM15和α5β1这两个蛋白的直接相互作用，表明ADAM15不是通过相互作用使α5在细胞表面富集。有报导认为ErkMAPK通路的激活能够抑制整合素的活化。相应地，我们发现在ADAM15过表达之后，Erk1/2磷酸化水平发生了大幅度的下调。干扰CHO/ADAM15细胞中ADAM15的表达，Erk1/2的磷酸化水平得到了恢复。检测MAPK家族的其他成员，p38和JNK的磷酸化水平都没有发生改变，说明ADAM15能特异性地抑制Erk1/2活化。进一步确证Erk1/2和α55分布之间的关系，我们发现采用Erk上游分子MEK1/2的特异性抑制剂PD98059抑制Erk1/2的磷酸化后，α5在细胞表面分布增加，而总蛋白不变。为了排除抑制剂可能存在的非特异性，我们采用Erk1/2的siRNA进行验证，得到了一致的结果。进一步我们发现用抑制剂或siRNA下调Erk1/2磷酸化水平后，细胞的迁移能力发生了相应的减弱。　　 综上所述，ADAM15通过降低Erk1/2磷酸化，驱使整合素α5β1在细胞表面分布，进而增强细胞的粘附能力和减弱细胞的迁移能力；在体内，ADAM15显著抑制B16F10细胞的肺转移。因此，本研究阐明了ADAM15调节细胞粘附和迁移的一个新机制，并且首次揭示了ADAM15在体内肿瘤转移过程中的作用。