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背景和目的非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)是一类起源于成熟T细胞的恶性肿瘤,是除去T/NK细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤等特指型外周T细胞淋巴瘤外的一组T细胞肿瘤。该肿瘤在我国及其他亚洲国家发病率较高,占到成人非霍奇金淋巴瘤的近20%,其进展快、预后差,在临床表现、病理形态学、免疫表现和和遗传学特征等方面都具有明显的异质性。尽管近来对该肿瘤的生物学和遗传学特征有一些研究,但是其发生、发展的分子机制仍不清楚。本研究目的是了解非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)的分子遗传学改变特征,从而为揭示其发生、发展的分子机制、分型、诊断、治疗及预后评估提供科学依据。方法比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)技术的基本原理是用不同的荧光染料(Cy3:蓝色;Cy5:红色)标记待测肿瘤的DNA和正常的基因组DNA,同正常人的中期染色体杂交,通过检测染色体上两种荧光信号的相对强度比率,了解待测组DNA拷贝数的改变,同时发现发生异常的染色体的位置。Array-CGH将基因组DNA转移到芯片上进行杂交,提高了检测灵敏度和精确性。本实验应用1Mb Array-CGH检测37例PTCL-NOS染色体改变,并使用Tile path array-CGH和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)验证其部分结果。根据克隆性分析结果、形态学特征和提取DNA质量,最终确定本研究对象。其具体步骤如下:1.收集解放军306医院、山西省肿瘤医院和上海长海医院病理科2001年10月-2008年12月存档的PTCL-NOS石蜡包埋组织标本47例,使用CD3抗体对5 m组织切片进行免疫组化染色,定性、定位肿瘤细胞,经手工显微切割法去除坏死组织等提高肿瘤细胞成分的比例;2. DNA提取:采用QIAamp DNA Mini Kit提取、纯化石蜡包埋组织的DNA,使用多重PCR(产物为100bp, 200bp, 300bp和400bpDNA片段)对DNA质量进行检测;3.克隆性检测:应用BIOMED-2多重PCR体系(美国InVivoScribe公司),分析T细胞受体基因重排的克隆性;4.应用1Mb Array-CGH检测PTCL-NOS染色体改变;并经Tile path array-CGH验证1Mb Array-CGH的部分1、6、7、14号染色体改变;5.应用FISH对1Mb Array-CGH部分结果进行进一步验证,确定或排除一些不确定的结果,同时可以发现一些染色体拷贝数目改变。结果1.经免疫组化染色和显微切割技术筛选后,对47例PTCL-NOS石蜡包埋组织进行DNA提取;经多重PCR检测提取DNA片段大小,结果显示:400bp,17例;300bp,10例;200bp+,10例;200bp,8例;100bp,2例。克隆性分析结果显示,26例为单克隆性,10例为多克隆性,1例结果不明确。选取DNA片段200bp+以上的37例PTCL-NOS进行1Mb Array-CGH分析,结果显示18例出现不同的染色体异常,19例未发现染色体异常。其中6例无明显染色体异常且呈多克隆基因型的病例,进一步复查组织切片未见明确的肿瘤性淋巴组织。因此,最终用于该研究的共31例,其中21例男性和10例女性,中位年龄52岁(12～75岁);11例发生在淋巴结,18例发生在结外组织,余2例部位不明;3例属于临床Ⅲ期,9例属于Ⅳ期,其余临床分期不清。25例获得临床随访资料,其中20例死亡,仅5例存活。2. 1Mb Array-CGH分析结果显示,31例中17例(55%)出现染色体异常改变,14例未发现染色体异常。频发性染色体获得(≥3例)的区域是:1p36.13-1p36.32, 1q21.1-1q23.3, 3p24.2-3p24.3, 3p13-3p14.3, 7q22.1, 7p22.1-7p22.,7q36.1-7q36.3,7q32.1-7q32.3,7q22.1-7q34,8q11.21-8q22.3,8q24.3,9p11.2-9q12,9q33.3-9q34.3和11p15.5,其中1p36.13-1p36.32,7q22.1,7q36.1-7q36.3,7q32.1-7q32.3,7q22.1-7q34,9p11.2-9q12和9q33.3-9q34.3是最常见的基因获得(≥4例)区域;频发性染色体缺失的(≥3例)区域是:1p21.2-1p12, 5q21.7-5q23.2, 6q24.2-6q25.3, 6q27,6q22.1,9p21.1-9p21.3,10q25.3-10q26.3,10p11.23-10q11.2,10q11.23-10q25.2,12p13.1-12p13.2, 2q24.11-12q24.3, 13q14.11-13q14.3, 13q21.3-13q22.2和13q13.3-13q14.3,其中1p12-1p21.1和13q14.11-13q14.3是最常见基因缺失的(≥4例)区域。另外,还发现1,3,4,5,7,8,9,11,14号染色体的多倍体和6,8,10,11,12,13号染色体的单倍体。3.上述数据经统计学方法(Kaplan-Meier检验、Pearson卡方检验及Cox回归分析)分析发现,1p36.13-1p36.32(包含基因APAJ1、FGR、TP73)的改变,10q、12p、13q的缺失与肿瘤预后密切关系,是引起预后不良的因素。4.高分辨率Tile path芯片CGH和FISH证实了一些上述重现性染色体片段的异常,也验证了1Mb芯片的结果的可靠性,并排除一些1Mb Array-CGH结果不确定的染色体改变。另外,FISH还发现7q34和14q11位点单拷贝数目的改变。结论1. CGH技术可以快速全面地分析肿瘤组织DNA拷贝数的变化,并在中期染色体上定位,是检测遗传不稳定性的好方法,对于淋巴瘤的分子遗传学研究具有重要意义。2.本次研究显示多数PTCL-NOS病例具有染色体异常改变,根据本次研究结果即染色体改变结合形态学、免疫组化染色,可以将PTCL-NOS分为高变组(染色体改变≥6个区域/例)和非高变组(染色体改变<6个区域/例); 1p36(包含癌基因FGR和抑癌基因NBL1、TP73等)改变组和无1p36改变组; 1p12-21.1 (包含基因RBM15)缺失组和无1p12-21.1组。绝大多数具有染色体异常改变的PTCL-NOS病例组织形态学往往呈现明显异型性,可以作为该肿瘤分子分型的重要依据。3.随访结果也表明,本组PTCL-NOS研究病例的高变组与非高变组总生存时间有显著差异,前者短于后者;1p36.13-36.32改变组的总生存期短于无改变组,有10q、12p及13q的缺失组的总生存期分别短于无缺失组。1p12-21.1缺失组的总生存期有低于无1p12-21.1缺失组的趋势,但无统计学意义,考虑可能是由于病例数较少所致,希望在以后的研究中积累更多病例以证实这一趋势。上述染色体的改变是引起PTCL-NOS患者预后不良的因素,可作为预后评估的一项重要指标。4.另外,FISH证实Array-CGH结果的同时,也可以得出基因拷贝数目的变化,有利于寻找该肿瘤特异性染色体改变。这些都为揭示PTCL-NOS遗传学特征等特点提供了可靠的科学依据。