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研究背景：环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)，又名前列腺素内氧化还原酶，是花生四烯酸代谢过程中的限速酶。COX存在两种亚型，即结构型的COX1和诱生型的COX2。COX1存在于绝大多数组织中，在生理状态下促进前列腺素生成，维护人体正常功能，如保持胃肠道粘膜的完整性、血管内平衡、激素应答等。COX2则在病理状态下可大量诱导产生，如在巨噬细胞、单核细胞等中可被诱导表达增加20倍以上，在某些癌前病变及肿瘤组织中亦大量表达，同时，有大量证据表明它与肿瘤发生之间存在联系。转基因动物实验发现，转导COX2过表达基因的小鼠大大增加了肿瘤的发生率；相反，COX2基因敲除的小鼠，其肿瘤的发生率则会降低。因此认为COX2与肿瘤发生之间存在“因”与“果”的关系。此外，有研究发现，敲除COX1基因同样可减少肿瘤的发生率，因而认为花生四烯酸代谢在肿瘤发生过程中有着重要的作用。形态学的研究也证实，COX2为抗肿瘤治疗的靶点，应用选择性COX2抑制剂，可减少肠癌、舌癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌及膀胱癌等在实验动物中的发生；对于已存在的肿瘤，则可抑制其生长和转移。流行病学的调查研究显示，长期服用非甾体类抗炎药(NSAIDs)可减少结直肠癌的发生率。新近的研究还发现，COX2可增加肿瘤细胞多样耐药基因(MDR1)的表达及活性，应用选择性COX2抑制剂可克服由于COX2过表达而引起的化疗耐药或放疗敏感性降低等疗效下降的问题。鉴于COX与肿瘤发生、发展的联系，其抑制剂，尤其是选择性COX2抑制剂，作为一种具有巨大潜在价值的肿瘤预防及治疗药物已引起了人们的重视。临床流行病学调查研究和动物实验均证实，COX抑制剂，特别是选择性COX2抑制剂可防治多种类型的肿瘤，且相关的Ⅱ期浙江大学硕士学位论文临床研究也已开展。传统的Cox抑制剂如NSAIDS，由于在抑制CoxZ的同时也抑制了COxl的生理功能，长期使用时往往有较大的副作用，因此特异性干预CoxZ一般可取得较好的效果而不产生大的副作用，筛选选择性COXZ抑制剂对于肿瘤的临床防治有着重大意义。中药制剂苦参总碱(Matrine，MAT)，叶绿酸铜钠(Sodium Copper Chlorophyllin，CHL)和内分泌治疗药物三苯氧胺(Tamoxifen，TAM)，为三种均已在临床中应用，而且被认为是在长期使用时副作用相对较小的药物。因此，本次研究中，我们选择这三种药物作为我们选择性COxZ抑制剂初步筛选的目标。MAT和CHL为两种目前已用于肿瘤辅助治疗的中药制剂。已有研究证实，MAT存在一定的抑瘤作用，可显著抑制白血病细胞K562等肿瘤细胞的增殖并诱导其分化;CHL也被认为存在抗突变、抗肿瘤作用。TAM广泛用于乳腺癌治疗，Brodie等发现，雌激素依赖乳腺癌患者肿瘤中存在芳香化酶和COxZ的高表达。COXZ的产物前列腺素E2 (prostaglandingEZ，PGE2)对肿瘤及其周围组织中的雌激素合成有着强烈的刺激作用，应用COXZ抑制剂可减少雌激素的产生。可见，MAT和TAM均己在临床上用于抗肿瘤治疗，而CHL也已在临床中应用且有实验室证据证明其具有抗肿瘤作用，但这三种药物与COXZ相关性的研究，目前均无报道，故本实验通过研究低浓度下这三种药物对Cox功能的影响，以期为筛选新的选择性COXZ抑制剂提供初步的依据，同时也为这三种常见药物的临床应用开辟新的领域。 研究方法:本实验所用HT29细胞为一人大肠癌细胞系，其COXZ为高表达。由浙江大学医学院肿瘤研究所提供。按要求培养细胞，实验时取对数生长期的HT29细胞，制备成单细胞悬液(2 x 105/ml)，接种于96孔培养板中，每孔2 xlo，，置于培养箱中培养，待贴壁完全后进行药物处理实验。按不同浓度梯度加入药物，每一浓度平行6孔，并设空白对照组6孔(不加药品)，TAM板另设溶剂对照孔，取DMSO体积分数为4%、2%各3孔。置培养箱中培养12小时后，以MTT法测定各药物的IC50。按试剂盒说明书要求配置及贮存ELISA测定所需各试剂。依据MTT法测定的药物IC50选择浓度，基本按1/2、1/4、1/8工CSO的梯度为药物作用浓度分别加入药物，每一浓度取平行孔6孔。另设空白对照组6孔，其中不加药物:设阳性对照组6孔，其中加 3浙江大学硕士学位论文入选择性COxZ抑制剂Celecoxib，浓度为0.lmg/ml。于药物作用12小时，用ELISA法测定各上清中PGEZ的浓度。以t检验法检验各药物作用前后上清中PGEZ浓度的的差异;以直线回归法检验药物浓度与作用之间的相关性。 结果:本研究测得三药物的工C50分别为:MAT:1 .778士0.194(mg/m1)，CHL:1 .660士0.174(mg/ml)，TAM:5.465士0.528(x 10一:，mg/ml)。然后基本按l/2、1/4、1/8 ICSO梯度为药物作用浓度进行实验。结果显示，各药物从高到低各浓度作用后，上清中PGEZ测定结果分别为，MAT:165.399士36.874、3 10.677士48.946、154.486.1 75士47.551、147.276士18.972(pg/ml);(Pg/ml):CHL7 16士43.050、580.563士27.801TAM171.710士22.841、]83.651士22.299、204.724士47.459(pg/ml);Celeeoxib:154.144士18.633(pg/ml)