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[研究背景]
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是起源于肝细胞的恶性肿瘤，是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤。HCC的发病率位居世界恶性肿瘤的第六位，其肿瘤相关死亡率高居第二位。由于慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发，全球新发HCC病例中大约有55％来自中国。虽然治疗效果明显改善，但HCC患者的临床治愈率和长期存活率仍较低。近年来兴起的靶向治疗为肝癌治疗带来了新的契机，但HCC靶向药物的种类有限且容易出现耐药，一旦耐药将会很快失效。因此，深入研究HCC的发病机制和探索潜在的有效靶点，来指导新的分子靶向治疗药物的研发有着十分重要的现实意义。
白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobulin-like receptors，LILRs)，又被称为免疫球蛋白样转录子(immunoglobulin-like transcript，ILTs)或单核细胞免疫球蛋白样受体或CD85(a-h)，是一组细胞表面表达的免疫球蛋白超家族分子。LILRS家族的B亚家族(LILRB)是一组免疫抑制性受体，通过其胞内免疫受体酩氨酸抑制基序(immune receptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs)发出信号，负向调控免疫细胞的活化。既往研究表明，LILRB亚家族的数个成员(如LILRB1、LILRB2和LILRB4)在血液系统恶性肿瘤细胞，如T细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病中异常高表达，且与肿瘤的疾病进展密切正相关。此外，LILRB1、LILRB2和LILRB4在多种实体恶性肿瘤，如非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌细胞中亦有高表达，且与肿瘤免疫抑制、肿瘤细胞增殖和侵袭转移等呈正相关。这些研究结果提示LILRBs是潜在的肿瘤治疗靶点。然而，目前国内外关于LILRB分子在HCC中的表达及在HCC疾病进展中的具体功能尚未见报道。
LILRB2又称作ILT4、LIR-2、MIR10、CD85d，是LILRB家族的典型代表，生理情况下其主要表达在单核细胞、树突状细胞和内皮细胞中。LILRB2可以诱导人DCs的耐受性表型，从而诱导产生抑制性T细胞，抑制T细胞的活化和增殖。近年来越来越多的研究表明LILRB2是一个功能强大的促癌分子，其在白血病、乳腺癌、NSCLC和胰腺癌细胞中过表达，且其促癌功能的发挥依赖于与其配体的结合。目前发现的LILRB2配体有两大类，一类是经典或非经典的组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子，在人类称之为人白细胞抗原(human 1eukocyte antigen，HLA)，其中结合力最高的为HLA-G;另一类是血管生成素样蛋白(angiopoietin-1ike proteins，ANGPTLs)，其中结合力最高的为ANGPTL2和ANGPTL5。本课题组前期研究发现LILRB2在NSCLC细胞系和组织中高表达，且与患者临床预后不良呈显著正相关。LILRB2和其两类配体ANGPTLs和HLA-G在NSCLC中存在共表达，且其配受体共表达与NSCLC患者临床预后不良呈显著正相关。分子机制上，一方面LILRB2可通过活化ERK信号通路促进NSCLC细胞增殖和迁移侵袭，另一方面可通过活化PI3K-Akt-mTOR通路上调免疫抑制分子B7H3的表达。综上所述，LILRB2在多种肿瘤中均表现出显著的促肿瘤进展的作用，是一个很有希望的肿瘤治疗靶点。然而，对于HCC中LILRB2的表达及其作用目前尚不清楚。
[目的]
明确LILRB2在HCC组织中的表达及其临床意义;明确LILRB2与其配体HLA-G在HCC组织中表达的相关性;明确LILRB2对HCC细胞恶性生物学行为的影响;探究LILRB2在HCC细胞中发挥作用的分子机制，为LILRB2在HCC治疗中的潜在价值提供理论基础。
[方法]
1、应用免疫组织化学方法，检测82例HCC肿瘤组织和64例癌旁组织中LILRB2的表达，分析LILRB2在癌组织和癌旁组织中的表达差异及其与患者临床病理参数之间的相关性。
2、应用免疫组织化学的方法，检测82例HCC肿瘤组织中HLA-G的表达，分析LILRB2和HLA-G表达的相关性。
3、随访82例HCC患者的生存预后，应用Kap1an-Meier法绘制生存曲线进行统计分析，采用1og-rank检验分析LILRB2的表达对HCC患者生存预后的影响。
4、通过Westernb1ot检测HCC细胞株中LILRB2基因的表达，选择内源性LILRB2低表达细胞株HepG2上调LILRB2表达，选择内源性LILRB2高表达细胞株SM-7721下调LILRB2表达。通过瞬时转染技术，过表达或干扰HCC细胞中的LILRB2表达。然后通过生长曲线，检测LILRB2对HCC细胞增殖能力的影响;通过AnnexinV-FITC/PI流式细胞术，检测LILRB2对HCC细胞抗凋亡能力的影响;通过Transwe11小室迁移侵袭实验，检测ILILRB2对HCC细胞迁移侵袭能力的影响。
5、通过慢病毒感染建立稳定过表达LILRB2的HCC细胞株HepG2/LILRB2及对照细胞株HepG2/MOCK;稳定干扰LILRB2的HCC细胞株SM-7721/shLILRB2及对照细胞株SM-7721/shNC，选择BALB/cNude裸鼠分别皮下注射上述细胞。观察LILRB2对HCC细胞体内成瘤能力的影响
6、通过慢病毒感染建立稳定过表达LILRB2的HCC细胞株HepG2/LILRB2及对照细胞株HepG2/MOCK;稳定干扰LILRB2的HCC细胞株SM-7721/shLILRB2及对照细胞株SM-7721/shNC，，选择BALB/cNude裸鼠分别尾静脉注射细胞。观察LILRB2对HCC细胞体内转移能力的影响
7、通过Westernb1ot检测LILRB2对HCC细胞中MAPK信号通路磷酸化水平的影响，并通过加入信号通路抑制剂，观察LILRB2过表达细胞株在抑制ERK信号通路后细胞增殖及侵袭迁移能力的变化。
[结果]
1、人HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达显著高于癌旁组织。
LILRB2主要在人HCC组织肿瘤细胞胞质中表达。70.73％HCC样本中LILRB2表达阳性(58/82)，而仅有28.13％癌旁组织中LILRB2表达阳性(18/64)。HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达水平显著高于癌旁组织。HCC细胞LILRB2阳性表达与男性(P=0.02)、原发肿瘤体积大小(P=0.042)和肿瘤细胞低分化(P=0.018)呈正相关。
2、人HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达和其配体HLA-G的表达呈正相关。
HLA-G主要在HCC细胞质和胞膜上表达。约52.44％肝细胞癌组织样本中HLA-G为阳性表达(43/82)。在LILRB2阳性表达的样本中，HLA-G表达阳性率为60.34％(35/58)，而LILRB2阴性表达的样本中，HLA-G表达阳性率仅33.3％(8/24)。LILRB2的表达与其配体HLA-G的表达显著正相关(P=0.026)。
3、人HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达与患者不良预后相关。
LILRB2阳性表达组HCC患者的中位生存时间为30个月，而LILRB2阴性表达组HCC患者中位生存时间为38个月。LILRB2阳性表达组患者的OS显著低于LILRB2阴性表达组(P=0.0438)。
4、LILRB2增强HCC细胞的增殖和迁移侵袭能力。
LILRB2在本实验室保存的3株HCC细胞株(HepG2，Huh7，SM-7721)中均有表达，其中HepG2表达最低，SM-7721表达最高。质粒瞬时转染，过表达LILRB2表达后，HepG2细胞的增殖及侵袭迁移能力增强，而抗凋亡能力无明显变化;反之，干扰LILRB2表达后，SM-7721细胞的增殖及侵袭迁移能力受到抑制。
5、LILRB2促进HCC细胞体内成瘤及转移。
通过皮下移植瘤模型证实LILRB2可促进HCC细胞体内成瘤及生长:过表达LILRB2后，肿瘤生长速度明显快于对照组，瘤体重量大于对照组;同样，干扰LILRB2表达后，肿瘤生长速度明显慢于对照组，瘤体重量小于对照组。
通过尾静脉注射模型证实LILRB2可促进HCC细胞体内转移能力:造模后6周取小鼠肺组织，计数肺部肿瘤细胞转移灶，并通过HE染色进行病理形态学观察。结果显示过表达LILRB2后，裸鼠肺组织中转移灶数目显明显多于对照组;干扰LILRB2表达后，裸鼠肺组织中转移灶数目明显少于对照组。
6、LILRB2通过激活ERK信号通路促进HCC细胞的恶性生物学表型。
Westernb1ot结果示:过表达LILRB2后，HepG2细胞中ERK的磷酸化水平升高;而干扰LILRB2后，SM-7721细胞中ERK的磷酸化水平降低。而不论过表达或干扰LILRB2，HCC细胞中JNK及p38通路的磷酸化水平均无显著变化。而且，在过表达LILRB2的HepG2细胞，加入ERK信号通路抑制剂U0126后，细胞的增殖及迁移侵袭能力均受到显著抑制。
[结论]
1、LILRB2在人HCC组织肿瘤细胞中高表达，与其配体HLA-G的表达呈正相关，且与HCC患者的预后不良相关。
2、体外体内实验证实LILRB2可增强HCC细胞的增殖、迁移及侵袭等恶性生物学表型。
3、LILRB2可通过激活HCC细胞中的ERK信号通路，影响HCC细胞的恶性生物学表型。
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是起源于肝细胞的恶性肿瘤，是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤。HCC的发病率位居世界恶性肿瘤的第六位，其肿瘤相关死亡率高居第二位。由于慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发，全球新发HCC病例中大约有55％来自中国。虽然治疗效果明显改善，但HCC患者的临床治愈率和长期存活率仍较低。近年来兴起的靶向治疗为肝癌治疗带来了新的契机，但HCC靶向药物的种类有限且容易出现耐药，一旦耐药将会很快失效。因此，深入研究HCC的发病机制和探索潜在的有效靶点，来指导新的分子靶向治疗药物的研发有着十分重要的现实意义。
白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobulin-like receptors，LILRs)，又被称为免疫球蛋白样转录子(immunoglobulin-like transcript，ILTs)或单核细胞免疫球蛋白样受体或CD85(a-h)，是一组细胞表面表达的免疫球蛋白超家族分子。LILRS家族的B亚家族(LILRB)是一组免疫抑制性受体，通过其胞内免疫受体酩氨酸抑制基序(immune receptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs)发出信号，负向调控免疫细胞的活化。既往研究表明，LILRB亚家族的数个成员(如LILRB1、LILRB2和LILRB4)在血液系统恶性肿瘤细胞，如T细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病中异常高表达，且与肿瘤的疾病进展密切正相关。此外，LILRB1、LILRB2和LILRB4在多种实体恶性肿瘤，如非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌细胞中亦有高表达，且与肿瘤免疫抑制、肿瘤细胞增殖和侵袭转移等呈正相关。这些研究结果提示LILRBs是潜在的肿瘤治疗靶点。然而，目前国内外关于LILRB分子在HCC中的表达及在HCC疾病进展中的具体功能尚未见报道。
LILRB2又称作ILT4、LIR-2、MIR10、CD85d，是LILRB家族的典型代表，生理情况下其主要表达在单核细胞、树突状细胞和内皮细胞中。LILRB2可以诱导人DCs的耐受性表型，从而诱导产生抑制性T细胞，抑制T细胞的活化和增殖。近年来越来越多的研究表明LILRB2是一个功能强大的促癌分子，其在白血病、乳腺癌、NSCLC和胰腺癌细胞中过表达，且其促癌功能的发挥依赖于与其配体的结合。目前发现的LILRB2配体有两大类，一类是经典或非经典的组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子，在人类称之为人白细胞抗原(human 1eukocyte antigen，HLA)，其中结合力最高的为HLA-G;另一类是血管生成素样蛋白(angiopoietin-1ike proteins，ANGPTLs)，其中结合力最高的为ANGPTL2和ANGPTL5。本课题组前期研究发现LILRB2在NSCLC细胞系和组织中高表达，且与患者临床预后不良呈显著正相关。LILRB2和其两类配体ANGPTLs和HLA-G在NSCLC中存在共表达，且其配受体共表达与NSCLC患者临床预后不良呈显著正相关。分子机制上，一方面LILRB2可通过活化ERK信号通路促进NSCLC细胞增殖和迁移侵袭，另一方面可通过活化PI3K-Akt-mTOR通路上调免疫抑制分子B7H3的表达。综上所述，LILRB2在多种肿瘤中均表现出显著的促肿瘤进展的作用，是一个很有希望的肿瘤治疗靶点。然而，对于HCC中LILRB2的表达及其作用目前尚不清楚。
[目的]
明确LILRB2在HCC组织中的表达及其临床意义;明确LILRB2与其配体HLA-G在HCC组织中表达的相关性;明确LILRB2对HCC细胞恶性生物学行为的影响;探究LILRB2在HCC细胞中发挥作用的分子机制，为LILRB2在HCC治疗中的潜在价值提供理论基础。
[方法]
1、应用免疫组织化学方法，检测82例HCC肿瘤组织和64例癌旁组织中LILRB2的表达，分析LILRB2在癌组织和癌旁组织中的表达差异及其与患者临床病理参数之间的相关性。
2、应用免疫组织化学的方法，检测82例HCC肿瘤组织中HLA-G的表达，分析LILRB2和HLA-G表达的相关性。
3、随访82例HCC患者的生存预后，应用Kap1an-Meier法绘制生存曲线进行统计分析，采用1og-rank检验分析LILRB2的表达对HCC患者生存预后的影响。
4、通过Westernb1ot检测HCC细胞株中LILRB2基因的表达，选择内源性LILRB2低表达细胞株HepG2上调LILRB2表达，选择内源性LILRB2高表达细胞株SM-7721下调LILRB2表达。通过瞬时转染技术，过表达或干扰HCC细胞中的LILRB2表达。然后通过生长曲线，检测LILRB2对HCC细胞增殖能力的影响;通过AnnexinV-FITC/PI流式细胞术，检测LILRB2对HCC细胞抗凋亡能力的影响;通过Transwe11小室迁移侵袭实验，检测ILILRB2对HCC细胞迁移侵袭能力的影响。
5、通过慢病毒感染建立稳定过表达LILRB2的HCC细胞株HepG2/LILRB2及对照细胞株HepG2/MOCK;稳定干扰LILRB2的HCC细胞株SM-7721/shLILRB2及对照细胞株SM-7721/shNC，选择BALB/cNude裸鼠分别皮下注射上述细胞。观察LILRB2对HCC细胞体内成瘤能力的影响
6、通过慢病毒感染建立稳定过表达LILRB2的HCC细胞株HepG2/LILRB2及对照细胞株HepG2/MOCK;稳定干扰LILRB2的HCC细胞株SM-7721/shLILRB2及对照细胞株SM-7721/shNC，，选择BALB/cNude裸鼠分别尾静脉注射细胞。观察LILRB2对HCC细胞体内转移能力的影响
7、通过Westernb1ot检测LILRB2对HCC细胞中MAPK信号通路磷酸化水平的影响，并通过加入信号通路抑制剂，观察LILRB2过表达细胞株在抑制ERK信号通路后细胞增殖及侵袭迁移能力的变化。
[结果]
1、人HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达显著高于癌旁组织。
LILRB2主要在人HCC组织肿瘤细胞胞质中表达。70.73％HCC样本中LILRB2表达阳性(58/82)，而仅有28.13％癌旁组织中LILRB2表达阳性(18/64)。HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达水平显著高于癌旁组织。HCC细胞LILRB2阳性表达与男性(P=0.02)、原发肿瘤体积大小(P=0.042)和肿瘤细胞低分化(P=0.018)呈正相关。
2、人HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达和其配体HLA-G的表达呈正相关。
HLA-G主要在HCC细胞质和胞膜上表达。约52.44％肝细胞癌组织样本中HLA-G为阳性表达(43/82)。在LILRB2阳性表达的样本中，HLA-G表达阳性率为60.34％(35/58)，而LILRB2阴性表达的样本中，HLA-G表达阳性率仅33.3％(8/24)。LILRB2的表达与其配体HLA-G的表达显著正相关(P=0.026)。
3、人HCC组织肿瘤细胞中LILRB2的表达与患者不良预后相关。
LILRB2阳性表达组HCC患者的中位生存时间为30个月，而LILRB2阴性表达组HCC患者中位生存时间为38个月。LILRB2阳性表达组患者的OS显著低于LILRB2阴性表达组(P=0.0438)。
4、LILRB2增强HCC细胞的增殖和迁移侵袭能力。
LILRB2在本实验室保存的3株HCC细胞株(HepG2，Huh7，SM-7721)中均有表达，其中HepG2表达最低，SM-7721表达最高。质粒瞬时转染，过表达LILRB2表达后，HepG2细胞的增殖及侵袭迁移能力增强，而抗凋亡能力无明显变化;反之，干扰LILRB2表达后，SM-7721细胞的增殖及侵袭迁移能力受到抑制。
5、LILRB2促进HCC细胞体内成瘤及转移。
通过皮下移植瘤模型证实LILRB2可促进HCC细胞体内成瘤及生长:过表达LILRB2后，肿瘤生长速度明显快于对照组，瘤体重量大于对照组;同样，干扰LILRB2表达后，肿瘤生长速度明显慢于对照组，瘤体重量小于对照组。
通过尾静脉注射模型证实LILRB2可促进HCC细胞体内转移能力:造模后6周取小鼠肺组织，计数肺部肿瘤细胞转移灶，并通过HE染色进行病理形态学观察。结果显示过表达LILRB2后，裸鼠肺组织中转移灶数目显明显多于对照组;干扰LILRB2表达后，裸鼠肺组织中转移灶数目明显少于对照组。
6、LILRB2通过激活ERK信号通路促进HCC细胞的恶性生物学表型。
Westernb1ot结果示:过表达LILRB2后，HepG2细胞中ERK的磷酸化水平升高;而干扰LILRB2后，SM-7721细胞中ERK的磷酸化水平降低。而不论过表达或干扰LILRB2，HCC细胞中JNK及p38通路的磷酸化水平均无显著变化。而且，在过表达LILRB2的HepG2细胞，加入ERK信号通路抑制剂U0126后，细胞的增殖及迁移侵袭能力均受到显著抑制。
[结论]
1、LILRB2在人HCC组织肿瘤细胞中高表达，与其配体HLA-G的表达呈正相关，且与HCC患者的预后不良相关。
2、体外体内实验证实LILRB2可增强HCC细胞的增殖、迁移及侵袭等恶性生物学表型。
3、LILRB2可通过激活HCC细胞中的ERK信号通路，影响HCC细胞的恶性生物学表型。