小麦法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因克隆及功能分析

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小麦面粉中的黄色素、棕色素等天然色素及类黄酮含量与面粉白度关系密切。黄色素包括类胡萝卜素、叶黄素和黄酮,其中小麦面粉中的类胡萝卜素含量与面粉白度呈负相关。类胡萝卜素是类异戊二烯物质,是通过小麦甲羟戊酸代谢途径合成的,其中法呢基焦磷酸合酶(FPPS)是此代谢途径中分支点的关键酶,它通过5个碳链长度的类异戊二烯1’-4顺序缩合的方式催化异戊烯焦磷酸和二甲基丙烯焦磷酸,首先形成10个碳的牻牛儿基焦磷酸,然后,与另一分子异戊烯焦磷酸缩合,形成特别重要的多分支点中间产物,即15个碳的法呢基焦磷酸。本文根据植物中法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列的高度保守区,设计了基因中间序列的扩增引物,通过RACE技术,从面粉白度较高的小麦品种济南13NO.和面粉白度较低的地方品种玉麦中分离克隆了法呢基焦磷酸合酶基因(FPPS),其编码区长度均为1065bp,编码354个氨基酸。对氨基酸序列分析发现,济南13NO.和玉麦法呢基焦磷酸合酶之间存在2个重要氨基酸残基的差异。为了验证克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因的功能以及研究差异氨基酸残基在酶促反应中的作用,分别构建了小麦济南13NO.和玉麦法呢基焦磷酸合酶基因的原核基因表达载体FPPS-pLM1以及通过基因定点诱变技术,获得了小麦济南13NO.法呢基焦磷酸合酶基因的突变体L278H和E295D。对小麦济南13NO.和玉麦法呢基焦磷酸合酶基因的野生型和突变体进行了原核基因表达和蛋白质分离纯化,并对获得的高纯度可溶性酶进行了酶促动力学研究。
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