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脑室周围白质软化(periyentricular leukolamacia,PVL)是目前早产儿脑损伤的最主要类型,为早产儿死亡和存活儿脑瘫和智力落后的主要原因.因缺血、感染等因素导致脑白质部位少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)前体的坏死和凋亡,致使髓鞘形成受损,是诠释PVL发病机理的主要学说.迄今对PVL尚无有效防治方法.近来对神经干细胞(neuralstem cells,NSCs)的系列研究,为早产儿PVL的治疗提供了新的思路.研究显示,对新生动物进行脑内NSCs移植,较成年动物具有更好的可行性.设想对大量丢失少突胶质细胞的PVL脑白质进行NSCs移植,使其分化形成OLs,促进脑白质髓鞘化,理论上应是治疗PVL最为理想的方案.目前国内外尚未见到NSCs移植治疗PVL的相关报道.
在上海市教委基金及院干细胞专项基金的资助下,本研究首先成功创建了以OL前体为主、与人类早产儿PVL病理相似的2日龄PVL动物模型；并制备了取自于大鼠胚脑、具有良好增殖和分化能力的NSCs；在此基础上,对PVL新生大鼠在建模后72小时进行了经脑室NSCs移植的对照研究.
一、早产儿脑室周围白质软化动物模型的创建通过对新生大鼠进行不同缺氧时间、不同缺血方法以及不同日龄的对照实验,并通过OLs系列标志物的免疫组化分析、光镜和电镜下的综合病理评估,证实对2日龄新生大鼠进行双侧颈总动脉结扎伴缺氧0.5h,可成功创建以脑白质损伤为主和髓鞘形成障碍为特征的PVL动物模型,效果肯定,重复性好,为下一步进行经脑室NSCs移植奠定了基础.
二、神经干细胞的制备、培养和鉴定采用E14胎鼠大脑皮层进行分离纯化培养,并对各代培养的神经球进行NSCs标志物Nestin鉴定,显示各代神经球均呈Nestine(巢蛋白,神经上皮干细胞蛋白)阳性,确认培养物为NSCs.进一步对第四代神经球作诱导分化鉴定,证实所制备培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,并具备向神经元(β-tublin阳性)、星形胶质细胞(GFAP阳性)及少突胶质细胞(04阳性)等神经细胞分化的良好能力,为下一步进行经脑室NSCs移植奠定了基础.
三、经脑室NSCs移植治疗PVL新生大鼠的实验研究对2日龄PVL新生大鼠在术后72小时进行经脑室NSCs移植治疗.外源性NSCs用PKH26荧光素标记,染色阳性率达95﹪.脑立体定位仪下经脑室穿刺部位:AP=1.5mm,ML=-2mm,DV=1.5mm；移植细胞密度:5×10<'4>/ul；移植总量:2ul；移植速度:0.5ul/min.应用激光共聚焦显微镜对植入NSCs进行动态观察,证实经脑室植入的外源性NSCs在脑内具有良好的迁移能力,三天内大部分移行至脑室周围区域,并分布在损伤严重部位.2周左右,NSCs在脑室周围区域主要分化为少突胶质细胞前体,部份分化为神经元及星形胶质细胞.移植后21天光镜下病理证实,未移植组脑白质呈轻度和重度病变各占50﹪；移植组则有30﹪白质完全正常,轻度和重度病变各占40﹪和30﹪.提示外源性NSCs移植可明显改善脑白质的病理损伤.移植后21天电镜证实,移植组脑白质部位的髓鞘形成显著增加,而未移植组则罕见髓鞘形成.提示外源性NSCs能在白质损伤区分化为少突胶质细胞前体,从而显著增加髓鞘的形成.本研究还证实,在移植物内加入胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),能进一步促进外源性NSCs分化为少突胶质细胞前体,增加髓鞘的形成,并显著改善脑室周围白质的病理损伤.
通过上述研究,本研究证实经脑室是对新生动物进行神经干细胞移植治疗的合宜途径.经脑室NSCs移植对脑室周围白质软化具有很大的治疗潜力,为今后成功防治早产儿这一最常见的脑损伤顽症提供了新的可行性途径,可望提高早产儿生存率和改善生存质量,提高人类素质.