人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是人体内存在的多区域丝氨酸蛋白酶，它可以特异性地激活纤溶酶原转变为纤溶酶，后者能在血栓局部有效地溶解血栓中的纤维蛋白，使血管再通。除此之外，t-PA还具有引起全身出血倾向小，溶栓后再凝趋势弱的特点。早在1980年，就已发现t-PA可以作为治疗如AMI等急性血栓的溶栓剂，从而引起人们的广泛关注。但t-PA在血中的半衰期甚短(3～5分钟)，在临床治疗中为维持其有效浓度，必须大剂量静脉滴注，从而增加了系统性溶出血的危险，同时也使其价格令人难以接受。所以，根据t-PA的结构与功能特性，针对t-PA本身所存在的种种缺陷，通过缺失与突变等分子生物学手段对其进行改构研究，以设计并研制延长其半衰期，降低系统出血倾向，提高特异活性，简化给药途径和价格便宜的新型t-PA便成为溶栓药物研究中的重要课题。 基于以上原因，本实验以野生型t-PA的cDNA序列为模板，利用PCR技术，自行获得了人组织型纤溶酶原激活剂t-PA cDNA的缺失突变体——rPA，并根据t-PA氨基酸序列中所存在的纤溶酶原抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)作用位点(Lys296～Arg299)与α2-抗纤溶酶作用位点(Ala473)，首次构建了rPA的定点突变体rPA(KHRR296～299AAAA)、rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR296～299AAAA／A473S)。 进一步将rPA及其突变体分别亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，获得表达载体pErA、pErA(K)、pErA(A)和pErA(KA)。酶切鉴定和序列分析均证明达到了预期的突变目的。表达载体转化大肠杆菌，经IPTG诱导，菌体裂解及SDS-PAGE电泳分析发现，仅缺失但无突变的pErA和突变的pErA(A)未表达目的蛋白，而突变体pErA(K)与pErA(KA)获高水平表达，蛋白产量分别占菌体总蛋白的35.97％与37.71％，分子量为39.6kD。Western blotting分析结果显示，表达产物与抗t-PA抗体呈特异性阳性反应。产物经初步纯化后进行复性与活性测定，结果表明，复性产物具有明显的体外纤溶活性。以上结果为rPA及其突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了物质基础。 参考t-PA cDNA的全长序列，扩增了t-PA的信号肽片段。并巧妙地以此为上游上物，结合原有的 t－PA 3 ＄端下游引物，以 PErA，PErA（K）原核表达载体为模板，构建了相应的真核表达载体PCSRA与PCSRK。酶切及测序结果均表明了构建的正确性。进一步以脂质体法将此表达载体分别转染至COSJ细胞，并同时设以pCDNA3刀为阴性对照。经FAPA检测，上述构建载体的表达产物阳性以及对照标准品卜PA具有良好的溶圈活性，阴性对照无溶圈产生。本实验为评A及其突变体在真核细胞的稳定表达奠定了基础。 在经过COS河细胞的瞬时检测，表明了pCSRA及pCSRK作为真核表达载体的可行性后，进一步以脂质体分别将其转入CHO＊hfr－，经G4及DMEM的双重选择后，获得了可表达pCSM与pCS队的细胞株。FAPA检测结果表明，表达产物具有良好的溶圈活性；经80℃平板灭活实验表明，表达产物具有特异性：Western blotting结果表明，表达产物具有特异的抗原性：纤维蛋白自显影表明，表达产物呈现自主溶圈带；稳定性实验表明，细胞株具有良好的稳定性。实验还对无血清培养基merum Free Medium，SFM）与常规 DMEM培养基培养条件下的细胞株的表达特性进行了比较。结果表明：其一，检测了24h，48h，72h的产物表达量，SFM培养条件下的表达产物均约为后者的2倍；SDS．PAGE电泳显示，SFM培养条件下的表达产物仅有少量的蛋白带，而DMEM培养条件下的表达产物则存在大量的蛋白带。从而进一步显示了SFM在生产药用蛋白方面的优越性。实验中稳定表达细胞株的建立为rPA及其突变体在临床的广泛应用作了必要的物质准备。