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副溶血性弧菌是我国一种重要的食源性病原菌,可引起急性肠胃炎,少数情况还能引发败血病,危及生命。副溶血性弧菌引起的疾病已成为我国一个严重的食源性公共卫生问题之一,该菌引发的疾病居微生物性食源性疾病暴发之首,目前发病人数呈显著上升趋势。特别在沿海地区,发病起数和涉及人数较我国其它地区更为严重,因此,必须建立可靠的快速检测方法,持续地进行水产品中副溶血性弧菌的主动监测和污染控制。目前对副溶血性弧菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法,免疫学方法和分子生物学检测方法等。传统检测方法操作繁琐,检测时间长,而且灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度也不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,而使其难以在基层普及和推广。2000年,Notomi等开发出一种新的核酸扩增技术,环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP),该技术以其灵敏度高、特异性强、快速、操作简便、检测成本低等优点在病毒、真菌、细菌以及转基因食品的检测中得到应用。因此,建立LAMP技术检测副溶血弧菌对于控制副溶血弧菌的食物中毒具有重要意义。
本文以副溶血弧菌具有种特异性的gyrB基因为靶基因(基因号AY527390),应用在线引物设计软件(https:／／primerexplorer.jp／lamp3.0.0／index.html)设计LAMP引物建立环介导等温扩增方法检测贝肉中的副溶血弧菌。对反应时间、反应温度、镁离子浓度等扩增条件进行优化,确定25μL的LAMP反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.6μmol／L,外引物(F3和B3)各0.2μmol／L,环引物(LF和LB)各0.8μmol／L,0.6mmol／LdNTP,2mmol／L Mg2+,2.5μL10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8u的Bst DNA聚合酶大片段,1μL DNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。LAMP反应过程是首先在65℃水浴锅中反应40min,然后将其放入80℃水浴锅中,水浴5min终止反应,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀,即可判断是否发生了LAMP反应,亦可通过琼脂糖凝胶电泳证实反应是否发生。本研究对13株副溶血弧菌、14株弧菌属菌株和19株非弧菌属菌株作对照,验证方法特异性,结果表明,13株副溶血弧菌检测结果为阳性,其他33株菌株为阴性。初步研究了6种从人工污染副溶血弧菌的贝肉中提取模板DNA的方法,结果表明,LAMP对制备模板DNA方法的要求不高。本研究对LAMP法快速检测副溶血弧菌进行了研究,确定了检测纯培养物的灵敏度,人工污染检出限,并与普通PCR检测方法进行了对比。结果表明:LAMP检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度为19CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的贝肉检出限为87CFU／g。采用试剂盒提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时2h。而对照,PCR检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度为1900CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的检出限为8700 CFU／g。采用同样方法提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时4 h。模拟贝肉样品含副溶血弧菌1CFU／g,样品经增菌2h后即可检出,检测周期4h,将本方法与行业标准GB／T4789.7-2008方法进行比较,确定LAMP方法敏感性为100％,特异性为98.72％,符合率为98.84％。研究表明,LAMP技术灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单,为快速检测贝类中副溶血弧菌构建了一个技术平台。