研究背景及目的:年龄相关性黄斑变性是西方国家五十岁以上人群致盲的主要原因,脉络膜新生血管是其严重病理结局之一,也是导致黄斑区病理性损害以及严重视功能损害的常见原因。脉络膜新生血管起源于脉络膜的微小血管,突破Bruch’s膜长入RPE下或者视网膜神经上皮下,由于新生血管的结构和功能不完整,新生血管容易发生渗漏和出血,液体或血液在视网膜下形成积液,影响中心视力,成为致盲的主要原因之一。目前抗VEGF治疗为CNV的主流治疗方法,且在临床上取得了显著疗效。但抗VEGF治疗因为需要重复注射,甚至终身用药,有20%-25%患者对于抗VEGF药物反应差或者无反应,说明CNV的发生发展还存在其他的病理机制,需要我们进一步探索,以利于寻找新的治疗靶点。近年来有不少研究证实,CNV与不少免疫因子也有密切关系,例如IL-6,IL-18,TGF-β以及补体系统成分均被证实参与到CNV的发生发展过程中。众所周知,蛋白是生命功能的执行者。蛋白质组学的概念是在1995年提出,是指在特定的空间和时间下,一种细胞,一种组织或者一种生物的全部基因组的表达情况,包括所有亚型或者修饰后的蛋白质的表达情况,本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征。由于疾病的发生发展往往涉及多种细胞、多种蛋白,而非某一种特定的蛋白在疾病中单独起作用,所以依靠蛋白质组学技术对疾病发生发展的机制的研究探索以及在疾病标志物方面的应用也迅速发展起来。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolutely quantification,iTRAQ）技术由美国应用生物系统公司（ABI）在2004年推出的一种体外的多肽标记技术。其工作的基本原理是将蛋白样品裂解为肽段,iTRAQ标记试剂与裂解后的肽段的N端或者肽段的赖氨酸的侧链发生反应,然后再进行一级二级质谱分析,报告基团的强度直接反映了所标记的肽段的相对丰度。因为iTRAQ蛋白组学具有灵敏度高,分辨率高,重复性好等特点,现已经被广泛应用于研究疾病的发生发展机制和寻找疾病的标志物等方面。尽我们所知,目前还未有对CNV动物模型的RPE-脉络膜-巩膜复合体蛋白进行iTRAQ蛋白组学分析的研究,而本课题组的研究即是为了对CNV大鼠及正常大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体蛋白进行iTRAQ蛋白组学分析以及生物信息学分析,并在结果中寻找我们感兴趣的和炎症有关的蛋白及其表型和机制进行进一步探索。本课题的研究目的即是用iTRAQ标记的蛋白组学方法探索CNV大鼠和正常大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体的差异蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析,从差异蛋白中选择部分感兴趣的蛋白质,用Western Blotting法进行验证;在验证成功的蛋白质中,选择我们感兴趣且有可能参与到CNV中的蛋白,对其在CNV中的作用进行探索,以助于丰富我们对CNV发病机制的理解和认知,以期为寻找新的治疗靶点提供思路和线索。方法:（1）激光造模:采用532激光对棕色挪威大鼠进行视网膜光凝造模,成功造模后,于造模后14天取9只CNV大鼠以及9只正常大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体,以用于后续的iTRAQ蛋白组学检测。（2）ITRAQ蛋白标记及鉴定:SDT裂解法提取蛋白质然后进行蛋白质定量,酶解,脱盐,肽段冻干后复溶,肽段定量。按照AB SCIEX公司iTRAQ标记试剂盒说明书进行标记。将每组标记后的肽段混合,采用AKTA Purifier 100进行分级。LC-MS/MS数据采集。质谱分析原始数据为RAW文件,用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行查库鉴定及定量分析。（3）生物信息学分析:利用blast2GO对目标蛋白质集合进行GO注释,过程大致可以归纳为序列对比（Blast）、GO条目提取（Mapping）、GO注释（Annotation）、和InterProScan补充注释（Annotation Augmentation）等四个步骤。KEGG通路注释:利用KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）软件,对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释。GO注释和KEGG注释的富集分析:采用Fisher精确检验（Fisher’s Exact Test）,比较各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况,对目标蛋白质集合进行GO注释或KEGG通路注释的富集分析。蛋白质聚类分析:首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理（归一化到（-1,1）区间）。然后,使用Complexheatmap R包（R Version 3.4）同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类（距离算法:欧几里得,连接方式:Average linkage）,并生成层次聚类热图。火山图:采用两组样本间的蛋白质表达差异倍数（Fold change）和T检验得到的P value两个因素共同绘制火山图,用于显示两组样本数据的显著性差异。横坐标为差异倍数（以2为底的对数变换）,纵坐标为差异的显著性P-value（以10为底的对数变换）。（4）Western Blotting法对目标蛋白进行验证:根据ITRAQ蛋白组学实验结果,查阅相关文献,根据差异蛋白的变化倍数以及差异蛋白在既往的研究背景,在差异蛋白中筛选出8个候选蛋白,采用WB法进行验证。在验证成功的蛋白中,因为TAB1的功能与蛋白组学结果相符合,筛选到TAB1蛋白,作为后续体内及体外的研究靶标。（5）将BN大鼠随机分为CNV组、CNV+AAV组（AAV空载病毒组,带有GFP荧光标签）、CNV+AAV-TAB1组（TAB1过表达组）,对三组大鼠分别进行PBS视网膜下注射,AAV空载病毒视网膜下注射,AAV-TAB1过表达重组载体注射,于注射后3天进行视网膜激光光凝造模,造模后7天,14天,30天及60天进行心脏灌注FITC-dextran,多聚甲醛固定眼球2小时,去除眼前节及眼内容物及视网膜神经上皮层,将RPE-脉络膜-巩膜复合体放射状剪开,荧光显微镜下观察病灶大小,计算各组BN大鼠的CNV病灶面积。（6）ELISA法检测大鼠RPE-脉络膜-巩膜匀浆中IL-18和IL-6的含量,明确TAB1基因在大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体中,对IL-18及IL-6分泌的影响。（7）提取BN大鼠RPE原代细胞,将细胞分为Adv组（腺病毒空载病毒组）和Adv-TAB1组（TAB1过表达组）,以200μM CoCl₂处理各组细胞,造成化学缺氧模型,模拟细胞缺氧状态。（8）CCK-8法检测各组细胞增殖情况,明确TAB1基因在缺氧环境下对大鼠RPE原代细胞增殖能力的影响;（9）在12小时,24小时,48小时及72小时后,ELISA法分别检测细胞上清中IL-18,IL-6的表达;（10）Werstern Blotting法检测非经典型Nf-kB信号通路分子的表达情况,探索TAB1影响大鼠RPE原代细胞增殖能力、IL-18及IL-6分泌的潜在机制。结果:（1）采用iTRAQ标记的蛋白质组学法,在正常大鼠及CNV模型大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体中一共鉴定到4380个蛋白质,与正常组相比,CNV模型组中有49个蛋白表达上调,241个蛋白表达下调。（2）差异蛋白质GO功能富集分析结果显示,在生物学过程方面,差异蛋白主要参与有丝分裂,免疫应答相关的细胞表面受体信号通路,转录负调控,DNA复制,细胞死亡的负调控以及细胞因子的分泌等生物学过程;在分子功能方面,差异蛋白主要参与染色质结合,跨膜受体的激活,解旋酶的激活,激酶的调节,酶抑制剂的激活等分子功能;细胞外基质成分,COPII囊泡衣被,核外泌体,肽链内切酶等定位蛋白质发生了显著性变化。（3）对差异蛋白进行KEGG通路注释富集分析,结果显示人乳头状瘤感染信号通路,PI3K-AKT信号通路,单纯疱疹病毒感染,结核感染,以及癌症相关信号通路发生了显著变化。（4）根据查阅差异蛋白的表达量,以及差异蛋白的研究背景,在290个差异蛋白中筛选了8个候选蛋白,用WB法对其进行验证,这8个蛋白分别是MCM7,YES1,SEPT9,p27kip1,p57kip2,RPIA,TRIM32,TAB1。验证到发生变化的蛋白有MCM7,TRIM32,RPIA和TAB1,这4个蛋白均在CNV模型组中有明显下调（p<0.001）。（5）脉络膜血管网铺片显示造模后第14天,第30天,第60天时,CNV+AAV-TAB1组较CNV组的病灶面积有明显下降（p<0.01,p<0.001,p<0.001）,而CNV+AAV组较CNV组在任一时间点上,其病灶面积均无明显变化。（p>0.05）（6）ELISA结果显示激光光凝后第14天,30天及60天,CNV+AAV-TAB1组大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体中,IL-18的表达量较CNV对照组的表达量明显上调（p<0.01,p<0.001,p<0.01）,而在这四个时间点,IL-18的表达在CNV+AAV组与CNV组之间均无明显差异（p>0.05）。在IL-6方面,造模后第14天,30天及60天,CNV+AAV-TAB1组大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体中,IL-6的表达量较CNV对照组的表达量明显下调（p<0.01,p<0.01,p<0.001）,而在这四个时间点,IL-6的表达在CNV+AAV组与CNV组之间均无明显差异（p>0.05）。（7）CCK-8实验结果显示在CoCl₂处理细胞24h,48h及72h后,Adv-TAB1组细胞的增殖情况高于Adv组（p<0.05,p<0.01,p<0.01）,而在12h这个时间点,两组细胞的数量无明显差异（p>0.05）（8）ELISA结果显示,在转染病毒后12h后,IL-18的表达在两组间无明显差异（p>0.05）,在转染病毒后24h,48h及72h后,IL-18的表达在Adv-TAB1组中明显高于Adv组（p<0.01,p<0.001,p<0.001）;IL-6方面,在转染后12h,两组间IL-6的表达无明显差异,而在转染后24h,48h及72h后,IL-6的表达在Adv-TAB1组中明显低于Adv组（p<0.01,p<0.01,p<0.01）。结论:（1）首次对CNV大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体进行蛋白组学分析,并鉴定到4380个蛋白质,在CNV中表达上调的有49个,下调的蛋白241个,说明iTRAQ蛋白组学的方法在大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体蛋白中的研究是可行的。（2）在差异蛋白中,很多蛋白参与到与细胞增殖、免疫相关的生物功能中,以及感染免疫相关的通路当中,说明细胞增殖和免疫效应在CNV当中起着重要作用。（3）从8个差异蛋白中验证到MCM7,TRIM32,RPIA,TAB1四个蛋白,为探索CNV的起病及发展机制提供了思路和线索,为寻找新的治疗靶点提供了思路。（4）体外实验中,TAB1在CNV大鼠视网膜下过表达,可明显减小CNV的病灶面积,并且上调IL-18的表达,下调IL-6的表达;在大鼠RPE原代细胞实验中,TAB1的过表达可提高细胞在缺氧环境中的的增殖能力和抗凋亡能力,并通过Nf-kB信号通路上调细胞的IL-18的分泌和下调IL-6的分泌,对CNV的发生发展起到抑制作用,对机体和RPE细胞起到保护作用,有望为治疗CNV提供新的思路和靶点。