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研究背景：三氯乙烯(TCE)是一种用途广泛的工业有机溶剂,在工业上作为脱脂剂、清洗剂和去污剂应用广泛。职业暴露三氯乙烯的工人出现三氯乙烯药疹样皮炎(DMLT)已经成为国内目前主要的职业卫生问题之一,有关TCE引起危害的病例时有报道,患者的临床表现主要是皮肤、肝脏、肾脏、神经等系统的损害。目前国内外相关研究主要在皮肤和肝脏等领域,对TCE引起肾脏损伤的作用机制研究较少,机制仍然不明。 研究目的：三氯乙烯皮肤致敏豚鼠后,根据不同时点豚鼠肾脏组织病理和超微结构改变,并结合肾功能和尿蛋白含量探讨三氯乙烯及其代谢产物对肾脏的损伤效应,此外,结合抑制剂研究肾脏组织内细胞因子和免疫复合物的沉积,利用免疫荧光、分子生物学技术探讨三氯乙烯及其代谢产物引起肾脏组织损伤的作用机制。 研究方法：选用体重250～300g/只,白色雌性豚鼠,经适应性饲养一星期后,随机分成空白对照组、溶剂对照组(橄榄油)、TCE组和2,4-二硝基氯苯(DNCB)对照组。采用豚鼠最大值试验方法建立豚鼠致敏模型,观察并记录豚鼠背部受试区的皮肤反应情况;依据《化学品毒性鉴定技术规范》中规定的皮肤反应评分标准对豚鼠皮肤反应进行评分;根据末次激发的不同时点对实验动物进行分组,收集不同组别豚鼠的血液、尿液,肾脏组织利用组织病理、电镜超微结构改变、ELISA和组织生化指标研究豚鼠致敏后三氯乙烯对肾脏的损伤效应。另购买一批豚鼠应用三种不同的抑制剂进行上述实验,应用组织病理、免疫组化,ELISA、分子生物学技术研究三种抑制剂对三氯乙烯致敏豚鼠肾脏损伤的拮抗作用,进一步分析三氯乙烯及其代谢产物在豚鼠致敏后对肾脏损伤的作用机制。 结果： 1.致敏率在皮肤致敏反应试验中,空白组、溶剂对照组及TCE14d组未见红斑或水肿,在TCE试验组的26只动物中有17只出现红斑水肿,致敏率为65.38％,DNCB实验组全部出现红斑或水肿。三种抑制剂实验组的致敏率为39.3%。 2.病理学检查结果HE染色和超微病理结果显示,TCE致敏组肾小球毛细血管基底膜节段增厚或者菲薄,足突部分融合,肾小管上皮细胞线粒体肿胀、空泡变性,微绒毛萎缩,个别小管呈萎缩状。NAC致敏组肾小管上皮细胞损伤不明显,PDTC和C5致敏组肾小管有不同程度的损伤,但明显低于TCE致敏组。 3.肾功能检查结果溶剂对照组肾功能各指标与空白组相比,差异无统计学意义(p>0.05);与溶剂对照组及TCE14d组相比,TCE致敏组两个时点肾功能均明显升高(P<0.05);与相应时点DNCB对照组相比,TCE致敏72h组升高(P<0.05),TCE致敏24h组高于未致敏24h组;PDTC致敏组、NAC致敏实验组BUN含量与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),C5抗体致敏组与空白组相比BUN含量无明显变化,NAC致敏组、C5致敏组的Cr含量与空白对照组的差异均无统计学意义。 4.mALB检测结果溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05);与溶剂对照组相比,TCE14d组、TCE致敏组及未致敏组豚鼠24小时尿液中mALB含量均明显升高(p<0.05);TCE致敏组尿液mALB含量与TCE14d组和TCE未致敏组相比,含量明显升高(p<0.05);NAC、PDTC和C5抗体致敏组mALB含量与空白组相比差异有统计学意义,PDTC致敏组与TCE致敏组的微量白蛋白含量的差异有统计学意义。 5.α1-MG检测结果溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏组、未致敏组各时点均明显升高,且差异有统计学意义(p<0.05);与TCE14d组相比,TCE致敏组和未致敏组豚鼠尿液中α1-MG含量均明显升高(p<0.05);PDTC致敏组与空白对照组的差异有统计学意义,与TCE致敏组的微球蛋白含量差异无统计学意义,NAC和C5抗体致敏组的微球蛋白含量与TCE致敏组的差异有统计学意义,与空白对照组无差别。 6.β2-MG检测结果溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏组各时点均明显升高(p<0.05);与TCE14d组相比,TCE致敏组尿液中β2-MG含量均明显升高(p<0.05);与TCE未致敏组相比,TCE致敏24h组豚鼠尿液中β2-MG含量明显升高(p<0.05);NAC致敏组的微球蛋白含量与空白对照组相比有差异,PDTC和C5致敏组β2-MG含量与空白组相比差异无统计学意义。 7.豚鼠组织匀浆IL-4、IFN-γ、TNF-α和C3含量的检测TCE24h致敏组、TCE72h致敏组的IL-4、IFN-γ、TNF-α含量与溶剂对照组相比差异有统计学意义,TCE24h致敏组与未致敏组IL-4含量的差异也有统计学意义,TCE72h致敏组的C3含量与溶剂对照组相比差异有统计学意义。NAC和C5致敏组IL-4含量与对照组的差别无统计学意义,NAC、PDTC和C5抗体致敏组的IFN-γ与对照组相比差异无统计学意义,三种抑制剂致敏组TNF-α含量与对照组相比差异有统计学意义,NAC实验组和C5实验组C3与对照组的差异均无统计学意义。 8.豚鼠组织免疫组化方法检测细胞因子和补体的表达不同实验组肾脏组织IL-4、IFN-γ、TNF-α、C5b-9和C3的表达相比差异均有统计学意义,溶剂对组与空白对照组相比差异无统计学意义,TCE致敏组与溶剂对照组相比差异有统计学意义,PDTC致敏组的C3含量与溶剂对照组相比差异有统计学意义,其余指标无差异,NAC致敏组五种细胞因子的表达与对照组相比均有统计学差异,C5抗体致敏组TNF-α、C5b-9的表达与空白对照组相比差异无统计学意义,其余指标均有统计学差异。 9.豚鼠组织TNF-α,MCP-1和C3mRNA水平检测不同实验组TNF-αmRNA含量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),TCE致敏组与溶剂对照组、PDTC、NAC和C5致敏组TNF-αmRNA表达的差异均有统计学意义;各个实验组MCP-1mRNA含量相比差异有统计学意义(P<0.05),TCE致敏组和C5致敏组与对照组相比差异有统计学意义,PDTC干预实验组和NAC干预实验组的目的基因的表达与对照组相比无统计学意义;各个实验组C3mRNA的表达与与溶剂对照组相比差异无统计学意义。 10.免疫荧光检测肾脏组织NF-κB的活化TCE致敏组有大量活化的免疫荧光阳性细胞,溶剂对照组无阳性着色,PDTC致敏组和NAC致敏组活化的染色细胞核数量较少,C5抗体致敏组中有一定量活化的NF-κB,但明显少于TCE致敏组。 11.MDA和SOD检测结果溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏24h组MDA含量明显上升(P<0.05);TCE致敏组与未致敏组比较差异有统计学意义(P<0.05),PDTC致敏组和C5抗体致敏组的MDA含量也高于空白组,差异有统计学意义,NAC致敏组与对照组相比差异无统计学意义。TCE致敏组SOD活性比溶剂对照组明显降低(P<0.05);TCE致敏24h、72h组SOD活性较非致敏组低,差异有统计学意义(P<0.05),PDTC致敏组和C5抗体致敏组的SOD活力低于空白对照组,差异有统计学意义。 结论： 1、采用豚鼠最大值试验可以建立TCE致敏模型,本实验条件下,TCE致敏率为65.38%,抑制剂实验组致命率为39.3%。 2、TCE处理可造成豚鼠肾脏的病理性和功能性损伤;TCE对豚鼠肾脏的损害不局限于肾小球,还累及肾小管,且对肾小管的损害程度重于肾小球,PDTC、NAC和C5抑制剂实验组肾小管损伤程度明显减轻,但重于对照组。 3、TCE对肾脏的作用机制不同于DNCB,TCE不单纯是致敏剂,也是免疫损伤剂。 4、三氯乙烯引起致敏豚鼠肾脏损伤可能是在迟发性变态反应的基础上引起免疫调节功能紊乱和氧化应激水平改变有关,这两种效应的共同作用引起肾脏组织NF-κB活化,释放细胞炎性因子进一步加重组织损伤。 5、PDTC、NAC和C5抗体能不同程度的降低三氯乙烯对肾小管上皮细胞的损伤作用。