研究背景:神经元是大脑的结构与功能单位之一,是具有不同膜结构域的高度极化细胞,结构上大致可分为胞体、轴突和树突,树突上又发出许多微小的突起,称为树突突起(dendritic protrusion),包括树突棘(dendritic spine)和丝状伪足(filopodia)。树突棘是树突上发出的一高度特异化的突起,长度一般不超过5μm,其内含有光面内质网、多核糖体、内涵体、溶酶体、线粒体等细胞器。丝状伪足(filopodia)是树突上发出的一具有高度运动性的细长突起结构,长度一般超过5μm,其内富含肌动蛋白,无任何明显的球状头部和细胞器。多项研究认为丝状伪足是树突棘的前体形式,也有人认为丝状伪足是树突棘的一特殊类型。树突棘、轴突末梢的小结及二者之间的间隙共同形成了突触,是神经元通信的结构基础。突触可塑性被认为是构成学习和记忆的重要神经化学基础,分为与传递效率有关的功能可塑性和与信息贮存相关的结构可塑性。树突棘数量或形态的变化参与突触可塑性的调节,了解树突棘或者树突突起形成的细胞机制能够扩展我们对正常和异常脑功能的认识。钙离子(Ca2+)在调节树突突起的形态和密度中起着关键作用,是诱导突触可塑性的基础。此外,突触传递还需要高水平的ATP,而线粒体通过其提供ATP和调节Ca2+稳态的能力在神经元发育和突触功能中发挥关键作用。线粒体内的钙稳态是通过 Na+-Ca2+交换通道(mitochondrial sodium calcium exchanger,mNCX)、H+-Ca2+交换通道(mitochondrial hydrogen calcium exchanger,mHCX)、线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)复合物和线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)来实现的。其中Ca2+通过MCU复合物进入线粒体,通过mNCX、mHCX和mPTP离开线粒体,短暂的mPTP开放可以快速释放Ca2+。mPTP的分子组成目前尚不明确,最近的多项研究认为F1FO-ATP合酶的二聚体,或者单体,或者其c亚基环参与mPTP的形成,尚无统一结论。但是亲环蛋白D(Cyclophilin D,CypD)是目前唯一在基因上确定的调节mPTP开放的分子。线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition,mPT)是指在特定诱导剂的存在下,mPTP开放,线粒体内膜对分子量<1,500Da的溶质的通透性突然增加,结果导致线粒体跨膜电位的消失、呼吸链解偶联、线粒体ATP合成停止和溶质的流入,造成线粒体基质扩张,线粒体肿胀,并引起细胞色素c释放和随后的半胱天冬酶活化,最终导致细胞死亡。因此,大家推测抑制mPTP的开放对细胞有保护作用。在许多疾病模型(如肌营养不良症、阿尔茨海默病、心肌梗死)中通过基因敲除或者药物抑制的方法阻断CypD的作用,从而干扰mPTP的开放,确实有保护作用。但是在心衰模型中,CypD缺失无保护作用,反而加重心衰。上述两种情况看起来似乎是相互矛盾的,CypD介导的mPTP开放到底是有害的,还是有有利的?越来越多的研究认为,CypD介导的mPTP开放分为长时程开放和瞬时开放。mPTP的长时程开放导致膜电位丧失,氧化磷酸化解偶联,线粒体基质肿胀,ATP消耗和活性氧物质增加,最终导致细胞死亡。而mPTP的瞬时开放可以导致线粒体膜电位的微小变化,这对细胞活力没有任何不利影响,并且可以减少线粒体内过量的代谢物和离子(特别是Ca2+),从而避免线粒体肿胀,阻止促凋亡因子的释放,最终保持线粒体的完整性。因此,mPTP的瞬时可逆性开放是一有用的生理过程,这也使得大家开始关注CypD及其介导的mPTP开放的生理作用。研究目的:1.明确CypD介导的mPTP开放对树突突起形成的影响;2.从CypD介导的mPTP开放对钙离子及其下游信号分子影响方面探讨其可能的机制。研究方法:1.原代神经元的培养:使用出生1天以内的Ppif+/+和Ppif-/-小鼠,分离其大脑皮层和海马,去除脑膜,将神经元种植于含Neurobasal A、B27、L-谷氨酰胺和抗生素的培养基中,置于37℃C含5%CO2的细胞培养箱内。培养至14天时进行相应的实验。2.Dsred慢病毒的包被:用磷酸钙法转染HEK 293T细胞,24小时后收集上清液,过滤,离心,收集的沉淀即为慢病毒颗粒。3.90mM氯化钾(KC1)处理神经元:90mM的KC1溶液在37℃C孵箱中孵育神经元3分钟,弃掉90mM的KCl溶液,使用提前预热的神经元培养基清洗细胞1遍,再加入神经元培养基,放入37℃C孵箱中孵育10分钟,这称为1个循环的KC1处理。后再重复上述步骤,直至完成4个循环。4.ATP的测量:使用Abcam ATP分析试剂盒,操作步骤按说明书进行。5.mPTP开放的检测:使用氯化钴淬灭的钙黄绿素AM(Calcein AM)染色。6.钙离子浓度的检测:使用Fluo-4 AM染色来检测树突内的钙离子浓度,使用Rhod-2 AM染色来检测线粒体内的钙离子浓度。7.蛋白免疫印迹:使用western blotting来检测控制线粒体融合/分裂以及钙离子信号转导的相应蛋白。8.细胞免疫荧光染色:用来检测神经元树突突起的数目和形态,以及线粒体在树突突起内的分布。9.染色图像的拍摄、处理和分析:使用尼康荧光倒置显微镜和共聚焦显微镜进行图像的拍摄,使用显微镜自带的尼康NIS高级研究软件进行图像的处理和数据分析。10.统计分析:使用Microsoft Excel(2007)进行数据的录入和简单计算分析,定量数据用均数±标准误表示。使用SPSS(21.0)软件进行数据的正态性检验和统计分析。两组间的比较多采用t检验,多组间的比较采用方差分析。P<0.05被认为有统计学意义。研究结果:1.神经元去极化引起CypD介导的mPTP瞬时开放。KCl处理的Ppif+/+神经元表现出树突线粒体Calcein AM染色强度的显著降低,而CypD敲除的Ppif/-神经元染色强度降低不明显(P<0.05)。KC1处理后,两种类型的神经元表现出相似的线粒体长度减少模式,相似的ATP水平变化。2.CypD缺失阻碍了神经元去极化诱导的树突突起的形成。在基线水平时,Ppif+/+和Ppif-/-神经元之间的树突突起、树突棘和丝状伪足密度没有显著差异。重复KCl刺激能够诱导Ppif+/+神经元树突突起密度的显著增加,其中以丝状伪足为主,树突棘变化不明显;而Ppif-/-神经元上述指标仅表现出轻度增加(P<0.05)。3.CypD缺失损害了神经元去极化期间树突线粒体钙离子动态的灵活性。在Ppif+/+和Ppif-/-神经元中,KC1处理能够诱导Fluo-4 AM染色强度显著升高,然后迅速下降至接近基线水平,然而,Ppif-/-神经元树突内钙离子回归基线水平的速度显著快于Ppif+/+神经元(P<0.05)。KC1处理后,Ppif+/+和Ppif-/-神经元的Rhod-2 AM染色强度均比其基线水平显著升高;但Ppif-/-树突线粒体的升高更为明显(P<0.01)。进一步的分析表明,大多数Ppif+/+树突线粒体属于钙离子“闪烁”型;而大多数Ppif-/-树突线粒体在神经元去极化期间处于钙离子“净增加”状态(P<0.05)。4.CypD缺失抑制神经元去极化状态下树突线粒体的运动。在基线水平时,Ppif+/+和 Ppif-/-和神经元中只有一小部分的树突线粒体处于运动状态,但Ppif+/+树突线粒体运动的更活跃(P<0.05)。去极化过程中,Ppif-/-树突线粒体迅速停止运动;而Ppif+/+树突线粒体在它们达到稳定之前仍在顺行和逆行方向上运动着(P<0.05)。并且,不论是在基线水平还是去极化过程中,Ppif+/+比Ppif-/-树突线粒体在前向和后向运动上的速度要快(P<0.05);去极化过程中,二者的运动速度皆下降。5.CypD缺失抑制神经元去极化状态下树突线粒体的重新分布。在静息状态下,6.32±2.76%的Ppif+/+树突突起含有线粒体,大约四分之一的Ppif-/-树突突起含有线粒体成分。在1个循环和4个循环的KCl诱导的去极化后,Ppif+/+树突突起含有线粒体的百分比分别显著升高至16.52±3.39%和23.52±3.82%,而Ppif-/-神经元含线粒体的树突突起的百分比几乎没有变化。6.CypD缺失不影响神经元去极化过程中控制线粒体融合和分裂的蛋白,但是抑制CaMKII和GluRl的磷酸化。在神经元去极化过程中,Ppif+/+和Ppif-/-两种神经元内OPA1和MFN2这两种线粒体融合蛋白及线粒体分裂蛋白DLPl的表达量没有发生显著变化;而DLP1的磷酸化水平(p-Drpl/DLPl)在去极化的过程丰显著下降但在这两种类型神经元之间无显著差异。KCC处理诱导了两种类型神经元中CaMKⅡα和β的活化,但Ppif+/+神经元对KC1诱导的CaMKⅡ α和β磷酸化的反应更强(P<0.05)。在KC1刺激后,Ppif+/+神经元中的磷酸化GluRI(p-GluRl)的水平远高于Ppif-/-神经元中p-GluR1的水平(P<0.05),而总GluRl的水平没有变化。7.CypD缺失减轻氧化应激环境中树突线粒体钙离子扰动和树突突起的损伤。H202处理的Ppif+/+神经元树突线粒体在氯化钾处理后,其钙离子水平显著下降,进一步的分析表明其大部分线粒体为钙离子“净损失”类型;而大多数Ppif-/-树突线粒体仍然具有缓冲钙离子的能力,尽管它们储存钙离子的能力也受损(P<0.05)。无论是静息状态下或KCl处理后,H2O2处理的Ppif+/+神经元比Ppif-/-神经元的树突突起密度显著降低(P<0.05)。结论:1.CypD介导的mPTP瞬时开放能够促进神经元去极化诱导的树突突起形成。2.在氧化应激条件下,CypD介导的mPTP长时间开放能够抑制神经元去极化诱导的树突突起形成。3.CypD介导的mPTP开放通过对线粒体钙离子稳态的调节,进一步影响线粒体在树突内的运动和分布,以及CaMKⅡThr286和GluR1 Ser831的磷酸化,最终影响树突突起的形成。