【摘 要】
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猪在体型大小、消化代谢和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型和异种器官移植研究的理想动物,转荧光蛋白报告基因的工具猪在异种移植、嵌合体和医学领域具有重要的
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猪在体型大小、消化代谢和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型和异种器官移植研究的理想动物,转荧光蛋白报告基因的工具猪在异种移植、嵌合体和医学领域具有重要的应用价值。本研究利用转基因技术、体细胞核移植技术和嵌合体技术,进行构建绿色荧光蛋白示踪的工具猪及嵌合体猪的研究。1、构建α-1,3半乳糖基转移酶敲除(GTKO)小型猪(巴马、五指山)原代耳成纤维细胞系,利用脂质体或电转染技术转染细胞系,G418筛选获得了可用于后续试验的绿色荧光蛋白(EGFP)和橘红色荧光蛋白(huKO)阳性细胞。2、EGFP阳性克隆点细胞为核供体进行体细胞核移植和胚胎移植,移植559枚胚胎到3头受体母猪,1头母猪分娩产出2个EGFP阳性克隆猪。采样心、肝、脾、肺、肾、胰腺、肠、胃、舌、大脑、小脑、脊髓和骨骼肌肉等13种组织进行石蜡切片观察、Western和实时定量PCR分析,结果显示EGFP为全身性表达,但是在肝脏、大脑、小脑和脊髓中的表达较弱。3、显微注射iPS细胞构建嵌合体胚胎,胚胎移植进行体内验证iPS细胞的全能性。共计移植602枚嵌合胚,获得9个胎儿(其中1-5#进行PCR检测)。通过小动物活体和体式荧光观测未发现有EGFP表达；PCR检测显示1#胎儿头部和2#胎儿胎盘检测到EGFP基因。4、通过注射和聚合法进行嵌合体猪的研究,共移植了436枚胚胎；但是未获得嵌合体胎儿。总之,本研究利用体细胞核移植技术成功获得了GFP广泛表达的GTKO猪,建立了制备嵌合体猪的平台。
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