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目的:本研究目的在于研究NEDD8修饰通路水平在原发性肝癌(HCC)中的显著改变,并揭示其在对于原发性肝癌病人预后的影响,评估该通路对原发性肝癌病人预后的重要预测意义,同时,通过经典的生物学实验发现其在原发性肝癌中的特异性的修饰底物。内容:本研究的基本内容包括,利用现有的实验方法和统计手段,研究证明了NEDD8修饰通路在原发性肝癌发生发展过程的上调现象,发现了NEDD8及其通路上的关键酶同病人预后的密切相关性,靶向该通路对治疗原发性肝癌病人的重要意义。同时,也发现了NEDD8在原发性肝癌中的特异性修饰底物靶蛋白α烯醇化酶(ENO1)和肝羧酸酯酶(CES1),并证明了抑制该修饰通路能够对底物蛋白表达水平产生影响。方法:首先,利用组织芯片的方法检测NEDD8分子在原发性肝癌中及其相对应的癌旁中的表达量,结合统计学分析的方法,分析其表达趋势,上调水平,以及NEDD8表达与HCC病人的预后的关系,同时结合COX回归模型对同预后相关的因素进行单因素及多因素的分析。其次,利用实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)的技术检测NEDD8修饰通路中各酶在原发性肝癌癌组织及对应癌旁组织中的m RNA的表达水平,同时利用免疫印迹(Western Blot)检测各酶在原发性肝癌癌组织及对应癌旁组织蛋白水平上的表达,利用对应的统计学方法统计分析各酶在癌与癌旁中的表达差异,同时分析其同预后的关系。最后,利用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)将被NEDD8修饰的底物沉淀下来,同时结合质谱成功测定出所形成的产物,利用Western Blot及Co-IP方法进行双向验证,另外,利用Western Blot的方法检测靶蛋白在NEDD8通路抑制剂处理下的细胞系里的表达水平。结果:首先,对NEDD8组织芯片的分析发现,NEDD8在原发性肝癌癌组织中较对应的癌旁组织显著上调表达(P<0.001,N=278),而且其表达同病人肿瘤多灶性生长(P=0.006)、病理分级(P=0.014)、血管侵犯(P<0.001)、HBe Ag(P<0.012)等密切相关,而且通过生存分析和单因素及多因素分析,发现NEDD8的表达能够影响原发性肝癌病人的预后(OS:P=0.049;DFS:P=0.002),并能够成为影响预后的独立危险因素(HR/95%CI:1.717(1.214-2.428)P=0.02)。其次,对通路上的三个关键酶NAE1、UBC12、UCHL1的m RNA(PNAE1<0.001,PUBC12<0.001,PUCHL1<0.001,N=126)及蛋白表达水平(PNAE1=0.037,PUBC12=0.017,PUCHL1=0.013,N=10)检测分析,发现他们均在原发性肝癌中显著上调,而且在m RNA水平上与病人的总体生存时间密切相关(PNAE1=0.015,PUBC12=0.040,PUCHL1=0.040,N=126),他们的高表达均对应着临床上原发性肝癌病人更差的总体生存时间。最后,我们通过Co-IP、质谱及Western Blot得到并验证了NEDD8修饰的靶蛋白ENO1和CES1,二者在原发性肝癌中均上调表达,同时也发现了抑制该通路能够使的靶蛋白CES1与ENO1上调表达,表示NEDD8修饰通路确实能够对靶蛋白表达量的产生影响。结论:本研究证明了NEDD8修饰通路在原发性肝癌中全面的显著上调,包括NEDD8及各个阶段的酶,而且他们在原发性肝癌中的表达均能够影响病人的总体生存时间,并且NEDD8的表达能够成为影响预后的独立危险因素,阐明了NEDD8修饰系统在评估预测原发性肝癌病人生存预后中的价值,同时发现了其修饰的特异性底物,并初步证明了抑制NEDD8修饰通路对靶蛋白的表达影响,预示着NEDD8可能通过对靶蛋白的修饰改变而参与得到肝癌的发生发展进程,并影响肝癌的生物学特性而影响病人的生存预后。