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花发育中各类花器官的形成是由各种器官特征决定基因来启动的,而在单性花中的研究表明器官原基的特征被决定以后,要继续发育分化形成具有正常形态和功能的器官,还需要有其它一些复杂的基因调控的参与。器官形态的基本模式是在原基发育早期被决定的,但对于器官特征决定后到正常器官形成前的这一发育阶段,利用传统突变体筛选的技术手段所能筛选到的突变体非常的少,这使得对于这一阶段发育调控机制的研究进展缓慢。其次,由于植物形态建成具有顶端生长的特点,各种器官在发育早期通常簇生于茎端,实际操作中很难有效地分离到研究所需的器官原基,解决这一问题的关键在于寻找一种有效的实验方法以获得早期原基特异表达或调节的基因。
为了从分子水平上了解植物雄蕊器官形成的调节机制,我们对水稻早期发育阶段的雄蕊进行了器官特异的基因表达谱分析。我们利用半薄切片及扫描电镜观察,根据雄蕊发育的形态学特征将水稻早期雄蕊分成七个发育阶段,每一阶段体现了特定的发育事件。其后采用显微解剖技术分离、收集了2、3、5、7期的水稻雄蕊,并收集了叶原基和第三叶全展时的叶中部组织作为实验的对照组,对提取到的样品分别进行了线性的反义RNA扩增。利用loop实验设计方案对水稻cDNA芯片进行杂交,共检测到了10254个EST的表达,分析结果表明在雄蕊及叶片不同时期之间表达存在差异的基因共有5000多个。揭示了水稻雄蕊早期发育过程中基因表达的特征。
结果分析发现,早期雄蕊发育的形态事件与基因的表达调控之间有着明显的关联,根据基因的表达变化情况可以将早期雄蕊的发育分成两个阶段。前一阶段主要是器官基本模式的构建过程,后一阶段主要是各种组织中各类细胞的分化过程。此外,我们实验对芯片结果进行验证,确定了26个可能参与水稻早期雄蕊发育的基因,其中AK066916和AK109536的同源基因被发现在酵母中和孢子的形成有关,AK066916在7期雄蕊中具有特异的高水平表达。AK065367基因在5、7期雄蕊中特异的高表达,该基因是一个油菜素内脂的受体激酶,另一个与蛋白降解途径有关的基因AK101994也在穗和雄蕊中特异的高表达,提示在雄蕊的发育过程中可能有这些调控途径的参与。此外还找到了三个可能参与早期雄蕊发育调控的转录因子AK073684、AK071939和U78891。我们利用RNA原位杂交技术分析了部分基因的表达特征,其中OsMADS7(U78891)的表达有明显的时空特异性,推测其可能与孢子的发生有着密切的联系。这些结果为进一步深入研究雄蕊发育的基因调控模式奠定了基础。
我们的研究表明,器官特异性表达谱分析可有效地用于对植物器官形成调节机制的研究。我们还发现,原基早期发育阶段基因表达所具有的多基因同时出现差异性表达的特征对器官形成可能具有决定性作用。对通过原基特异性表达谱分析技术所找到的大量差异表达基因进行功能分析,不仅有助于我们深入认识器官形成早期的基因表达调控机制,还能为进一步发掘及利用“雄性不育”来进行作物改良提供新的思路和线索。