【摘 要】
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细胞色素P450酶是一类广泛分布于生物体中含血红素的蛋白质超家族,能够将一个氧原子引入到一些化合物的非活性C-H键中,并普遍具有严格的区域和立体选择性。作为一类天然的生物催化剂,它能识别的底物类型以及催化功能丰富多样,在药物结构修饰方面发挥重要作用。甾体药物作为目前市场销售额仅次于抗生素的第二大类药物,具有多种生理活性,对其进行结构修饰以获得更具应用价值的甾体药物是目前常用的手段之一。通过化学合成
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细胞色素P450酶是一类广泛分布于生物体中含血红素的蛋白质超家族,能够将一个氧原子引入到一些化合物的非活性C-H键中,并普遍具有严格的区域和立体选择性。作为一类天然的生物催化剂,它能识别的底物类型以及催化功能丰富多样,在药物结构修饰方面发挥重要作用。甾体药物作为目前市场销售额仅次于抗生素的第二大类药物,具有多种生理活性,对其进行结构修饰以获得更具应用价值的甾体药物是目前常用的手段之一。通过化学合成法对甾体药物进行结构修饰具有步骤多、得率低、价格昂贵等缺陷,而利用P450酶进行生物转化使得甾体药物的生产更加方便、经济,这对生物制药领域的发展具有重要意义。本研究以来源于Streptomyces cyaneofuscatus A102的GE639与来源于Streptomyces avermitilis MA-4680T的CYP107X1作为研究对象,从体外转化与全细胞生物转化两个方面探究GE639对甾体药物的催化作用,从体外转化和晶体结构入手,探究CYP107X1对孕酮的羟基化作用并且解析了CYP107X1底物未结合状态下的晶体结构。本研究主要内容如下:（1）在还原伴侣Pdx/PdR的作用下对GE639进行底物筛选,发现在体外转化的条件下对孕酮、雄烯二酮、睾酮、17α-羟基孕酮、可的松和雌二醇具有催化作用,在全细胞生物转化的条件下对孕酮、雄烯二酮和睾酮具有催化作用。通过与16α-羟基孕酮和雌三醇的标准品比较确定GE639能够催化孕酮和雌二醇的16α-羟基化。对GE639与底物进行亲和力测定,发现与睾酮亲和力最高,而与可的松的亲和力最低。（2）在还原伴侣Pdx/PdR的介导下对CYP107X1进行底物筛选,确定CYP107X1能够催化孕酮的16α-羟基化。光谱分析表明,CYP107X1与孕酮的具有较高的Kd值,为65.3±38.9μM,可能是与铁配位的水分子没有被底物完全取代而造成的。我们解析了无底物状态下CYP107X1的晶体结构,其活性中心存在一个来自于缓冲液的甘油分子,此外我们还发现了在CYP107X1结构中I螺旋上的一个相对保守的苏氨酸被替换成了天冬酰胺,而这个天冬酰胺的出现可能意味着CYP107X1在催化过程中采取了一种非天然的质子传递机制。
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