背景／目的：Peutz-Jeghers综合征（Peutz-Jeghers Syndrome, PJS, MIM#175200）是一种以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发息肉为特征的罕见常染色体显性遗传病。胃肠道多发息肉在患者青少年时期常常引起肠套叠、肠梗阻、消化道出血；随着年龄增长,PJS患者不仅消化道息肉有恶变潜能,还可伴发生殖系统和其他许多器官的良性或恶性肿瘤,其家族的癌症发病率也较普通人群为高。目前尚无干预措施能根治和预防PJS发病及息肉恶变。因此,研究PJS相关致病基因、息肉发生及恶变的途径和机制具有非常重要的理论和现实意义。PJS致病基因STK11/LKB1基因编码的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶是迄今发现的唯一一个抑癌作用的蛋白激酶,其属于AMPKK家族成员,通过对AMPK的变构调节,实现对能量代谢的调控；还可能通过转录因子SPI对VEGF产生负向调控,抑制细胞的增殖,也可能通过调控细胞周期,使细胞周期停滞G1期、促进细胞凋亡,抑制细胞增殖；在诱导神经细胞极性的形成中,通过与STRAD蛋白形成复合物而活化后,KB1S431A过量表达（一种丝氨酸-丙氨酸突变）,抑制轴分化；另有报道,STK11基因在非小细胞肺癌的极性调控中,可能通过JNK信号通路,对转录因子AP-1、c-Jun、JunD和ATF2进行调控,提高转录活性参与细胞极性形成。然而,关于PJS息肉形成及恶变机制的研究仍处于初级阶段。近年来,有报道PJ息肉为腺瘤样息肉,可发生癌变；另有报道错构瘤本身也可能演变为腺瘤和癌,即存在着由错构瘤→腺瘤→腺癌的演变过程；还有学者认为有两种机理导致PJS患者恶变,即错钩瘤→腺瘤→腺癌途径和de nove的恶变途径。然而,PJS错构瘤性息肉发生不典型增生/腺瘤样变的频率较低,因此,研究PJS息肉恶变的途径和机制一直是该领域的瓶颈。随着对PJS疾病的深入研究,探讨STK11/LKB1基因的突变类型、突变位点与PJS患者发生恶性肿瘤的关系,已成为该领域基础研究和临床研究的焦点。Lim W等报道PJS患者STK11/LKB1基因第三号外显子突变,发生恶性肿瘤风险高；Mehenni H则认为该基因第六号外显子突变与恶性肿瘤相关；Schumacher发现其羧基端和VIB-VIII功能区的错义突变与恶性肿瘤的关联更为密切,而移码缺失与剪切位点突变被认为与恶性肿瘤的发生无关,乳腺癌的发生主要由截短突变引起。然而,这些发现并没有被其他独立的PJS人群所证实。目前,PJS致病基因STK11/LKB1在不同研究人群中显示出较大差异的突变率（50%-90%）,基因型和表型的关系尚无定论,且PJS患者息肉恶变风险、恶变途径尚存争议。这些群体间的差异,不仅由于潜在的群体遗传学分层,样本量偏小也是重要原因,导致研究结果存在一定程度的分歧、无法在大规模人群中重复。可见,增加标本量,建立PJS家系生物标本库,做好随访工作,是进行这一罕见遗传病研究迫切需要解决的问题。本课题探讨建立PJS家系生物标本库的标准化程序,研究并制定规范化的组织及血液样品等生物标本采集、处理、保存操作流程,建立功能完善、信息丰富的PJS家系生物标本库。在此基础上,对PJS患者进行临床病理特征分析,探讨PJ息肉的病理演变过程,评估中国PJS患者发生恶性肿瘤的风险；并进行分子遗传学分析,绘制STK11/LKB1基因突变图谱,寻找中国PJS患者STK11/LKB1基因可能存在的突变热点区域及基因型和表型的关系；应用Protein Pathway Array技术进行PJ息肉蛋白质组学分析,识别与PJ息肉发生发展可能相关的信号传导通路蛋白以及潜在的分子治疗靶点。方法：1、借鉴国内外标本库建立的标准化程序,收集全国范围内PJS患者及家系正常人的血液标本和息肉组织标本,采用收集-反馈-修改的模式对标本收集的操作流程不断完善,并健全各种管理和质量控制措施。2、分析61个中国PJS家系133例PJS患者的临床病理资料,探讨PJ息肉的病理演变过程,评估中国PJS患者发生恶性肿瘤的风险。3、联合应用Sanger测序和MLPA检测技术,对52个PJS家系（遗传性家系25个,散发性家系27个）共计116例PJS患者、95例PJS家系正常人,进行STK11/LKB1基因突变筛查,并分析基因型和表型的关系。4、选取明确STK11/LKB1基因突变检测结果的28例PJS新鲜息肉组织和35例结肠癌癌旁正常组织（无STK11/LKB1基因突变）,应用Protein Pathway Array技术筛选与PJ息肉相关的蛋白表达谱,并用Western Blot和I雌予以鉴定。5、统计方法：数据处理采用SPSS17.0软件包,计数资料分别计算例数和所占比例,构成情况间的差别用χ2检验或Fisher’s精确检验,应用Student’s t-test和Significant Analysis of Microarray（SAM）进行差异蛋白质的筛选。以P<0.05,Q<5为有统计学差异。结果：1、初步建立中国PJS家系生物标本库通过制定标准化的标本收集流程,我们收集了61个PJS家系（28个遗传性家系和33个散发性家系）,133例PJS患者以及95例家系正常成员的生物标本,包括全血、血清、新鲜息肉组织、息肉蜡块组织以及正常粘膜组织,采集了完整的临床病理资料,并记录长期跟踪随访信息（尤其是息肉切除、息肉病理及恶性肿瘤发生的信息）,初步建立了PJS家系生物标本库。定期随机抽取样本提取DNA和蛋白进行检测,证明所收集的标本具有较高质量。2、中国PJS患者临床病理特征的分析分析133例PJS患者的临床病理资料,发现85例（64%,85/133）患者经历过至少一次外科剖腹手术（1-5次）,第一次手术的平均年龄为17.29岁（3-68岁）,多发息肉或体积较大息肉引起的小肠套叠或肠梗阻是导致外科手术的主要原因。16例（12%,16/133）患者的息肉出现错构瘤伴轻/中度不典型增生,患者平均年龄30.4岁,息肉直径均在3厘米以上,2枚息肉位于胃底,9枚分布于小肠,1枚位于直肠,其余息肉分布于结肠。25例PJS患者（18.8%,25/133）合并了27例恶性肿瘤,消化道肿瘤占66.7%（18/27）,其次为乳腺癌和妇科肿瘤,占25.9%（7/27）,另有白血病和肺癌各一例；其中2例PJS患者分别合并两种不同的恶性肿瘤,一例合并小肠癌、宫颈癌,另一例合并小肠癌、乳腺癌；患者发生恶性肿瘤的平均年龄为37.4岁（27-68岁）。3、Sanger测序法检测STK11/LKB1基因突变应用Sanger测序对52个PJS家系进行STK11/LKB1基因的突变筛查,27例先证者（51.9%,27/52）中检测到25种不同的STK11/LKB1基因突变,包括8个错义突变和17个截短突变,突变均与家系表型共分离,且在50例正常对照中未发现相同突变；其中,10种突变（40%,10/25）与PJS患者合并恶性肿瘤相关,包括胃肠道恶性肿瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌及白血病；14种（56%,14/25）突变为首次报道的新的病理性突变,包括四个缺失突变（c.151-162del12, c.308₃17del10, c.834₈35delTG c.898-906del9）、三个插入突变（c.402-403dupTG, c.892-893insC, c.402-403dupTG）.两个无义突变（c.783C>G,c.904C>T）、两个剪切位点突变（IVS2-1G>A,IVS5+2T>C）以及三个错义突变（c.862G>A, c.866T>G,c.891G>C）。值得注意的是,8个突变（8/27,29.6%）位于STK11/LKB1基因第七号外显子,是STK11/LKB1基因九个外显子中最短的一个,仅编码19个氨基酸,疑似中国PJS患者的突变热点。4. MLPA技术检测STK11/LKB1基因大片段缺失/重复应用MLPA技术检测25例Sanger测序未发现STK11/LKB1基因突变的PJS先证者,发现8例（15.4%,8/25）先证者存在该基因的大片段缺失,其中4例为1号外显子缺失（c.-1114-?₂90+?del）,1例为3号外显子缺失（c.375-?₄64+?del）,1例为3-9号外显子缺失（c.375-?₁365+?del）,1例为4-6号外显子缺失（c.465-?₈62+?del）,1例为6号外显子缺失（c.735-?862+?del）;三个PJS家系合并恶性肿瘤的发生,包括结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和宫颈癌。5、分析基因型和表型的关系遗传性PJS家系STK11/LKB1基因突变率为80%（20/25）,高于散发性家系的突变率55.6%（15/27）（p=0.06）；在116例PJS患者中,18例（21.7%,18/83）携带STK11/LKB1基因突变的患者发生恶性肿瘤,5例（15.2%,5/33）未携带基因突变的患者合并恶性肿瘤（p=0.462）；此外,5个插入突变和3个（3/4）无义突变所在的8个PJS家系中均合并了恶性肿瘤的发生,而所有剪切位点突变（5个）和小片段缺失突变（4个）所在的家系中未合并恶性肿瘤。6, STK11/LKB1基因第Ⅺ功能区突变与PJ息肉发生不典型增生相关将检测出的27个STK11/LKB1基因突变位点按照STK11蛋白不同的功能区（Ⅰ-Ⅺ）进行分组,发现10个（37%,10/27）突变位于STK11蛋白第Ⅺ功能区（277-309氨基酸残基）,其中9个（90%,9/10）突变与胃肠道错构瘤性息肉发生不典型增生相关,且携带不典型增生息肉的患者平均年龄26.8岁（16-44岁）；然而,在STK11蛋白第Ⅰ-Ⅹ功能区的17个基因突变中,仅有2个（11.8%,2/17）突变与PJ息肉发生不典型增生相关；两组相比较,有显著性差异（p=0.0001）。随后,回顾性分析了HGMD数据库中PJS患者STK11/LKB1基因突变与恶性肿瘤的关系,发现76.9%（10/13）的Ⅺ功能区突变与恶性肿瘤相关。7.p-p38MAPK蛋白在STK11/LKB1基因Ⅺ功能区突变的PJ息肉中表达显著升高为进一步探讨STK11/LKB1基因第Ⅺ功能区突变与恶性肿瘤相关的机制,应用Protein Pathway Array技术对PJ息肉组织和正常肠粘膜组织进行蛋白质组学分析,比较13例携带STK11/LKB1基因Ⅰ-Ⅹ功能区突变的PJ息肉与4例Ⅺ功能区突变的PJ息肉中蛋白表达的差异,发现Ⅰ-Ⅹ功能区突变的PJS息肉中p-p38MAPK蛋白表达高于正常肠粘膜1.83倍,而Ⅺ功能区突变的息肉中该蛋白表达高于正常肠粘膜3.23倍,两组比较,p-p38MAPK蛋白表达差异具有统计学意义（p=0.003）,并用Western Blot验证了该结果。8. Galectin-3蛋白可能成为抑制PJ息肉生长的分子治疗靶点除p-p38MAPK蛋白外,应用Protein Pathway Array技术对28例PJS息肉组织和35例正常肠粘膜组织进行蛋白表达的筛选中还发现39种差异蛋白,13种蛋白在PJ息肉组织中呈高表达,26种蛋白呈低表达,并用Western Blot和IHC验证了Galectin-3,GSTP1, NQO1,COX-2及ICAM-1蛋白的表达,肯定了Protein pathway array实验结果的可靠性。其中,Galectin-3（半乳糖凝集素-3）蛋白在PJ息肉中的表达是正常粘膜的7倍,在PJS错构瘤和发生不典型增生的息肉中均呈胞浆强阳性表达,且其抑制剂低分子柑橘果胶（MCP）毒副作用极小,故该蛋白有望成为抑制PJ息肉生长的分子治疗靶点。9、应用IPA （Ingenuity Pathway Analysis）数据分析平台预测PJ息肉发生机制综合PJ息肉中筛选出的差异蛋白,我们分析STK11/LKB1基因突变后可能激活p38MAPK蛋白,从而通过调节炎症反应（COX-2, ICAM-1）和代谢途径（Galectin-3, GSTP1, NQO1）引起PJ息肉的形成,且p-p38MAPK蛋白可能在STK11/LKB1基因第Ⅺ功能区突变息肉发生不典型增生的病理演变过程中发挥重要作用。结论：1、规范化操作流程的建立有利于提高PJS家系生物标本收集的效率、提高标本库质量（包括生物样本和系统临床随访资料）,具有创新性和较强可操作性。2、首次报道中国PJS患者STK11/LKB1基因突变率,达67.3%,绘制了中国PJS患者STK11/LKB1基因突变图谱,且第七号外显子可能是中国PJS患者的突变热点,并发现14种新的致病突变。3、提出一种新的基因型和表型的关系,即STK11/LKB1基因第Ⅺ功能区突变与PJS患者错构瘤性息肉发生不典型增生相关；并发现p-p38MAPK蛋白可能在这一病理演变过程中发挥重要作用。4、发现Galectin-3蛋白可能成为抑制PJ息肉生长的潜在治疗靶点,其天然抑制剂低分子柑橘果胶（MCP）有望应用于PJS患者临床治疗。5、中国PJS患者因肠梗阻／肠套叠首次行剖腹手术（64%）、PJ息肉出现错构瘤伴轻／中度不典型增生（12%）以及PJS患者合并恶性肿瘤（19%）的年龄均较轻,平均年龄分别为17.29岁、30.4岁和37.4岁,为制定良好的监测方案提供重要依据,积极预防肠梗阻及恶性肿瘤的发生。