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目的 人内皮细胞特异性分子-1(Human endocellular-specific molecule-1，ESM-1)表达载体的构建及其体外表达，表达产物的纯化及多克隆抗体和单克隆抗体的制备。重组MEK(mitogen-activated protein kinase／external-signal regulated kinase kinase，分裂原激活的蛋白激酶／胞外信号调节激酶的激酶)基因的真核转染，转染的内皮细胞中ESM-1的表达。方法 用PCR方法扩增ESM-1的基因片段，扩增产物与T-Vector连接，构建克隆载体pGEM-T-ESM-1。在宿主菌中扩增重组质粒，提取质粒并进行酶切纯化，将目的基因插入pET-28b中构建成表达载体，再次转化入大肠杆菌XL1-blue，蓝白选择、耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆，经限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法鉴定。然后提取质粒，转化入大肠杆菌BL-21，用IPTG诱导表达。表达产物行SDS-PAGE，割下所需条带，用电洗脱方法纯化得到所需目的蛋白。免疫新西兰纯种大白兔，制备多抗，并用免疫双扩散法测定抗体效价；免疫BALB／C小鼠，制备抗人ESM-1的单克隆抗体。用重组MEK基因转染人脐静脉内皮细胞ECV304，加以鉴定，并检测转染细胞中ESM-1表达的改变。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为pET-28b-ESM-1重组质粒，SDS-PAGE证实获得的融合蛋白分子量为24kD，表达量约占菌体总蛋白的24％。所得多抗效价为1：16(免疫双扩散)，单抗效价为1：6000(ELISA)。重组MEK基因转染成功，用Western blot和免疫荧光的方法检测显示，转染不同活性型重组MEK基因的ECV304其ERK-2(external-signal regulated kinase-2，胞外信号调节激酶-2)的表达量不同，ESM-1的表达量在转染不同活性型重组MEK基因的细胞中也不同，都是转染高活性型的细胞中表达量最高，转染野生型的细胞中次之，未转染的ECV304中表达最少。结论 成功获得ESM-1安徽医科大学硕士学位论文张素梅·2003年的表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，成功制备了抗ESM一1的多克隆抗体和单克隆抗体。在转染了不同活性型重组MEK基因的ECV304细胞中，ESM一1的表达量有改变，在转染高活性型重组MEK基因的细胞中表达量最高，转染野生型重组MEK基因的细胞次之，未转染的ECV304中ESM一1的表达量最少。说明ESM一1可能是MAPK(mitogen一aetivated protein kinase，分裂原激活的蛋白激酶)信号转导通路上的一个重要的成分，并在肿瘤转移以及肿瘤血管生成中发挥作用。