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目的CD8+T淋巴细胞在机体抗HIV-1感染的免疫反应中具有细胞毒性和非细胞毒性的免疫应答（CD8+T cell non-cytotoxic anti-virus responses，CNAR）。细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）是细胞免疫反应中杀灭HIV的主要效应细胞，但是单纯靠CTL介导的细胞免疫作用不足以保护机体免受HIV感染。CNAR功能通过分泌抗病毒因子抑制HIV感染细胞及HIV复制，在抗HIV感染中具有重要作用。近年来，国外关于CNAR功能的研究主要以无症状感染者为研究对象，对疾病长期不进展者（Long term non-progressors，LTNP）和艾滋病期的患者研究较少。LTNP是HIV-1感染超过10年，未经任何抗病毒治疗，CD4+T淋巴细胞数大于或等于500x106个／l，未出现艾滋病指征性症状的患者，疾病呈现长期不进展状态。CNAR功能可能在维持LTNP较好的免疫功能中发挥了重要作用，但其机制尚未明确。IL-15是一种多功能的细胞因子，能够促进体内NK细胞和记忆性T淋巴细胞分化和增殖，在机体抗病毒感染中发挥重要作用。国外研究显示IL-15能够增强无症状感染者CNAR功能，但CNAR功能在LTNP中的变化以及是否与IL-15相关国内外均未见报道。本研究以中国HIV感染LTNP为对象，研究其外周血中CD8+T淋巴细胞CNAR功能的变化及IL-15对CNAR功能的影响，并与HIV组、AIDS组及健康对照组进行比较，探讨其与疾病进展的关系。方法1、研究对象：由中国医科大学艾滋病研究所、辽宁省疾病预防与控制中心以及吉林省疾病预防与控制中心、河南省疾病预防与控制中心艾滋病确认实验室经Western blot试验确认为HIV阳性标本52例，所有标本均在未接受抗病毒治疗前采集。根据HIV感染者CD4+T细胞数量和感染时间进行分组。LTNP组：CD4+T淋巴细胞≥500个／μl，HIV感染10年以上，未经抗病毒治疗，无艾滋病指征性症状；HIV组：CD4+T淋巴细胞介于200-500个／μl之间，无艾滋病指征性症状；AIDS组：CD4+T淋巴细胞＜200个／μl或出现艾滋病指征性症状。其中LTNP组17例，HIV组28例，AIDS组7例，健康对照组8例。每例采集EDTA抗凝全血9ml。2、T淋巴细胞绝对计数：将20μlCD4／CD8／CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μlEDTA抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血450μl，室温避光15min，用FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。3、病毒株TCID50检测：HIV病毒株为中国CDC参比实验室惠赠的实验室毒株SF33。提取健康人外周血单个核细胞（Peripheral blood monouclear cells，PBMC），PHA刺激3天，用RPMI-1640（含100U／ml IL-2）重悬，调整浓度为4×106个／ml，放入37℃、5％CO2孵箱中待用。在96孔板中部选12孔，每孔加入180μl RPMI-1640，PBMC 50μl。每孔加入200μl病毒，在板上做4倍系列稀释。3天后换液，第7天测p24，计算TCID50。4、CD4+T／CD8+T淋巴细胞的分选：用密度梯度离心法提取8例健康对照和52例HIV感染者的PBMC。采用德国Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分选装置，严格按照说明书进行操作。每1×107个细胞加20μl抗CD4或抗CD8免疫磁珠，10℃结合25min。300g离心μlin，500μ1缓冲液重悬细胞，经LS柱子进行阳性分选。取少量分选后细胞加入6μlCD4-FITC、6μl CD8-PE及6μl CD3-PerCP，用流式细胞仪Cellquest软件检测分选细胞纯度。5、T淋巴细胞的体外培养：用37℃水浴复苏病毒。准备15ml离心管，每管加入5×105个CD4+T细胞和600TCID50的病毒，并用1ml吸管轻轻吹打20次，混匀后37℃、5％CO2孵箱共培养3h。300g10min离心两次，洗去游离的病毒，向每管加入0.5ml RPMI-1640 （IL-2100U／ml），重悬使细胞浓度为1×106个／ml。将预刺激72h的CD8+T细胞重悬，调整浓度到1×106个／ml。将CD8+T细胞和CD4+T细胞以2：1、1：1、0.5：1的比例加入到48孔板中，固定CD4+T细胞的数量为0.4×106个／孔，每个浓度设2个复孔，同时设定2个阴性对照。调整每孔的液体总量为1.2ml。37℃、5％CO2孵育，每3天换液收集上清600μl，同时补充600μl RPMI-1640，培养至15天。在实验孔中加入IL-15，浓度为300ng／ml，对照孔中只加入细胞，培养15天。6、p24检测：采用Biomerieux公司的p24检测试剂盒，严格按照操作说明书进行。结果用pg／ml表示，最低检测范围是5pg／ml。7、CNAR功能分析：将收集5次的上清p24值用Excel绘制折线图，应用Origin7.0软件计算曲线下面积，根据下列公式计算出CNAR功能。CNAR功能％=（对照组面积-实验组面积）/对照组面积×100％8、统计学分析：用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析，数据经转换后为正态分布。用方差分析（one-way ANOVA）进行不同组间的均值比较。用直线相关来比较CNAR功能与CD4+T淋巴细胞绝对值及HIV-1 RNA病毒载量的相关性。P＜0.05认为有统计学差异。结果1、CD4+T／CD8+T淋巴细胞的纯化用免疫磁珠法纯化CD4+／CD8+T淋巴细胞，细胞纯度大于95％。2、HIV感染LTNP的CNAR功能LTNP组的CNAR功能高于HIV组、健康对照组和AIDS组（P＜0.01）。3、CNAR功能与CD4+T淋巴细胞绝对计数和病毒载量相关性52例HIV感染者的CNAR功能与CD4+T细胞绝对计数呈显著正相关（r=0.2，P=0.022），与病毒载量不呈显著负相关（r=-0.144，P=0.308）。4、IL-15对疾病不同进展期CNAR功能的影响经独立样本T检验分析，加入IL-15组和未加入IL-15组CNAR功能存在著性差异（P＜0.05），加入IL-15组CNAR功能高于未加入IL-15组。且增高值AIDS＞HIV＞LTNP。结论1．我国LTNP的CNAR功能高于HIV组、健康对照组和AIDS组（P＜0.01）。提示CNAR功能可能是我国HIV感染疾病长期不进展的保护性因素。2．加入IL-15组CNAR功能高于未加入IL-15组，且增高值AIDS组最显著。提示IL-15可实验性应用于HIV-1的免疫治疗。3．52例HIV感染者CNAR功能与CD4+T细胞绝对计数呈显著正相关，提示CNAR功能与HIV感染者疾病进展有关，是监测HIV感染者免疫状况、预示疾病进程的一个新指标。