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子宫内膜异位症是一种常见的良性妇科疾病，但部分病例异位病灶的深部浸润、远处转移以及反复复发的临床特性一直困扰着妇科临床医生，而甲氨蝶呤作为一种常用的化疗药物，在用于妇科妊娠滋养细胞疾病等治疗的同时，也可用于良性疾病如异位妊娠、胎盘植入等的治疗。本课题组前期关于盆腔子宫内膜异位症发病危险因素的流行病学调查亦初步提示，既往的化疗史可能是子宫内膜异位症发病的保护因素，因此本研究采用荧光活体成像／分析技术、免疫组织化学和流式细胞术，观察在模型鼠子宫内膜异位症发生、发展和维持的整个过程中，甲氨蝶呤对异位内膜生长及其分泌粘附相关细胞因子VEGF、ICAM-1、E-cad的影响，旨在为甲氨蝶呤用于某些难治性子宫内膜异位症的临床治疗提供初步的动物实验基础。本课题分以下三个部分进行研究：第一部分复制人子宫内膜异位症小鼠模型目的：复制人子宫内膜异位症小鼠模型。方法：1．应用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）转基因和野生型C57BL／6J小鼠复制人子宫内膜异位症的小鼠同系异体子宫内膜腹腔注射诱发模型；2．造模2周后处死小鼠并开腹，于Olympus SZX16荧光体视镜下行异位内膜荧光成像，同时进行荧光强度三维成像，并计算荧光表达的光密度（OD）值；3．于镜下分别取异位内膜、子宫和卵巢行病理形态学检测。结果：1．造模2周后处死小鼠置于荧光体视镜下观察，可见异位种植的子宫内膜均存活，于肠管间、子宫旁、腹壁下、肝小叶下或脾周形成绿色团块状或星点状内膜异位病灶，并可见肠管间、内异灶与腹壁、脾周形成的粘连带，复制模型成功率100％；2．病理形态学检测可见典型的异位子宫内膜腺体及间质，提示成功复制动物模型。结论：成功复制人子宫内膜异位症的小鼠同系异体子宫内膜腹腔注射诱发模型；此模型发现病灶更为敏感，且可对病灶荧光表达情况进行量化处理，使得实验结果更加准确、客观。第二部分造模后腹腔注射甲氨蝶呤对小鼠异位内膜生长及粘附的影响目的：观察造模后腹腔注射甲氨蝶呤对子宫内膜异位症模型小鼠异位内膜生长及粘附能力的影响。方法：1．复制人子宫内膜异位症的小鼠同系异体子宫内膜腹腔注射诱发模型；2．造模2周后对照组（D组）给予等量的生理盐水腹腔注射，实验组分别给予25mg／kg（A组），50mg／kg（B组），75mg／kg（C组）的甲氨蝶呤腹腔注射；3．1周后处死小鼠并开腹，于Olympus SZX16荧光体视镜下行异位内膜荧光成像，同时进行荧光强度三维成像，分析比较各组小鼠异位内膜的荧光表达强弱，并计算OD值；4．于荧光体视镜下分别取异位内膜、子宫和卵巢行病理形态学检测，流式细胞仪检测异位病灶的凋亡情况，免疫组织化学检测各组小鼠异位内膜细胞因子VEGF、ICAM-1、E-cad的表达情况。结果：1．造模小鼠置于荧光体视镜下观察，可见异位种植的子宫内膜存活；2．对照组（D组）异位内膜体积较大，荧光表达较强，OD值也较大，实验组异位内膜体积较小，荧光强度较弱，OD值亦较小，且这种差异随着药物剂量的增加而增加（P＜0.01）；3．流式细胞术发现各组小鼠异位内膜细胞的凋亡随着药物剂量的增加而增加（P＜0.01）；4．对照组异位内膜细胞因子VEGF、ICAM-1的表达均较实验组强（P＜0.05），但E-cad的表达与A组间差异无显著性意义（P＞0.05），A、B组小鼠异位内膜细胞因子VEGF、ICAM-1的表达均呈弱阳性，A组与B组间VEGF的表达差异无显著性意义（P＞0.05），但A组小鼠ICAM-1表达稍强于B组小鼠（P＜0.05）。B组小鼠E-cad的表达呈阴性，C组小鼠的异位内膜VEGF呈极弱的表达，而ICAM-1、E-cad的表达均呈阴性（P＞0.05）。结论：甲氨蝶呤可明显抑制模型鼠异位内膜的生长并诱导其凋亡，使得异位病灶体积缩小，荧光表达减弱，且这种作用呈剂量依赖；甲氨蝶呤可抑制模型鼠异位内膜细胞因子VEGF、ICAM-1、E-cad的分泌，且这种作用同药物剂量相关。目的：观察造模前腹腔注射甲氨蝶呤对子宫内膜异位症模型小鼠异位内膜生长及粘附能力的影响。方法：1．小鼠随机分组，对照组（D组）给予等量的生理盐水腹腔注射，实验组分别给予50mg／kg（A组），75mg／kg（B组），100mg／kg（C组）的甲氨蝶呤腹腔注射；2．3天及1周后，分别处死部分C组未造模小鼠，HPLC法检测甲氨蝶呤不同时间点的血药浓度及子宫、肝、肾内药物浓度，绘制药物浓度曲线，给药1周后复制人子宫内膜异位症的小鼠同系异体子宫内膜腹腔注射诱发模型；3．在此2周后处死模型小鼠，于Olympus SZX16荧光体视镜下行异位内膜荧光成像，同时进行荧光强度三维成像，分析比较小鼠异位内膜的荧光表达强弱，并计算光密度值；4．于荧光体视镜下分别取异位内膜、子宫和卵巢行病理形态学检测，流式细胞仪检测异位内膜的凋亡情况，免疫组织化学检测各组小鼠异位内膜分泌细胞因子VEGF、ICAM-1、E-cad的情况。结果：1．造模小鼠置于荧光体视镜下观察，可见异位种植的子宫内膜存活；2．给药三天和一周后，血清及肝、肾组织内均未检测出甲氨蝶呤存在；3．对照组（D组）异位内膜体积较大，荧光表达较强，OD值也较大，实验组异位内膜体积较小，荧光强度较弱，OD值亦较小，且这种差异随着药物剂量的增加而增加（P＜0.01）；4．流式细胞术发现三个实验组分别与对照组相比，细胞凋亡差异均具有显著性（P值均＜0.05），三个实验组间比较，A组、B组分别与C组相比，细胞凋亡差异有显著性（P值均＜0.05），A组与B组间细胞凋亡差异无显著性（P值＞0.05）；5．对照组异位内膜细胞因子VEGF的表达同A组小鼠差异无显著性，但较另外两组强（P＜0.05），ICAM-1的表达均较实验组强（P＜0.05），对照组E-cad的表达呈弱阳性，而三组实验组小鼠均呈阴性。A组小鼠异位内膜细胞因子ICAM-1的表达呈弱阳性，B组小鼠ICAM-1、E-cad的表达呈阴性，而C组小鼠的异位内膜VEGF、ICAM-1、E-cad的表达均呈阴性。结论：造模前腹腔注射甲氨蝶呤可明显抑制模型鼠异位内膜的生长并诱导其凋亡；造模前腹腔注射甲氨蝶呤亦可抑制模型鼠异位内膜细胞因子VEGF、ICAM-1、E-cad的表达。总结：异位内膜种植前后腹腔注射甲氨蝶呤均可抑制人子宫内膜异位症模型小鼠异位内膜细胞的生长并诱导其凋亡，亦可抑制模型鼠异位内膜分泌粘附相关细胞因子VEGF、ICAM-1、E-cad，提示随着对化疗药物毒副作用的深入了解和防治措施的加强，甲氨蝶呤可能有望选择性地用于某些难治性子宫内膜异位症的临床治疗及复发的预防。