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目的结核病严重危害人类健康，耐药结核防治形势尤为严峻。分枝杆菌噬菌体能裂解结核分枝杆菌，具有潜在药用价值。本研究旨在通过对分枝杆菌噬菌体生物学特性、基因组学和血清学的研究筛选分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂的配方噬菌体。体外观察噬菌体鸡尾酒制剂杀灭结核分枝杆菌的能力以及耻垢分枝杆菌对鸡尾酒制剂的耐药突变频率，评价噬菌体鸡尾酒制剂的安全性，探讨其抗耐药结核病治疗的潜力。方法1.对噬菌体的形态、MOI、增殖周期和宽噬率等生物学特性进行系统研究，从分枝杆菌噬菌体D29、33D、TM4、Legendre、DNAIII、BO4、Leo、Clark和Sedeg中初步筛选出裂解能力强、裂解谱广的噬菌体，作为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒疗法配方噬菌体的备选项。2.鸟枪法对初步筛选出的噬菌体进行全基因组测序，生物信息学进行基因预测及初步的基因注释，以排除溶原性噬菌体和含有致病基因的噬菌体。3.中和实验和交叉中和实验测定鸡尾酒疗法配方噬菌体的吸附常数和交叉吸附常数以确定噬菌体自身的抗原性及噬菌体之间是否存在交叉吸附表位；通过体外杀菌（耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌）实验，比较噬菌体鸡尾酒疗法与D29体外杀菌能力；终点滴定反浊法测定耻垢分枝杆菌对鸡尾酒制剂配方噬菌体的耐药突变频率；改构噬菌体的剂型，将改构剂型与裸噬菌体分别对豚鼠滴鼻给药，比较在不同时间点到达豚鼠肺部的噬菌体数量及其存活情况。4.根据药典行过敏检查和热源检查，评估噬菌体鸡尾酒制剂的安全性；巨噬细胞吞噬噬菌体实验，观察噬菌体被巨噬细胞清除的过程；噬菌体鸡尾酒制剂滴鼻实验，观察给药期间小鼠活动情况和体重的变化，于给药8周后对小鼠进行解剖，观察脏器肉眼病变程度，同时行脏器病理组织学检查。结果1．噬菌体D29噬菌斑圆形透明，直径5nm；D29尾长129nm；最佳MOI为10-4；D29感染宿主菌的潜伏期约为50min，裂解量为10；D29能裂解所有受测结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体33D噬菌斑圆形透明，直径2nm；33D尾长201nm；最佳MOI为10-5；33D感染宿主菌的潜伏期约为150min，裂解量为24；33D能裂解95.65%的结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体TM4噬菌斑圆形透明，直径1.5nm；TM4尾长177nm；最佳MOI为10-4；TM4感染宿主菌的潜伏期约为150min，裂解量为28；TM4能裂解91.30%的结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体Legendre噬菌斑圆形透明，直径1nm；Legendre尾长215nm；最佳MOI为10-4；Legendre感染宿主菌的潜伏期约为180min，裂解量为13；Legendre能裂解91.30%的结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体DNAIII噬菌斑浑浊，边界模糊；DNAIII尾长208nm；最佳MOI为10-4；DNAIII感染宿主菌的潜伏期约为165min，裂解量为28；DNAIII能裂解78.26%结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体BO4噬菌斑圆形透明，直径1nm；BO4尾长215nm；最佳MOI为10-4；BO4感染宿主菌的潜伏期约为120min，裂解量为37；BO4能裂解86.96%的结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体Leo噬菌斑圆形透明，直径1.5nm；Leo尾长211nm；最佳MOI为10-5；Leo感染宿主菌的潜伏期约为150min，裂解量为74；Leo能裂解86.96%的结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体Clark噬菌斑圆形浑浊，边界模糊；Clark尾长227nm；最佳MOI为10-4；Clark感染宿主菌的潜伏期约为150min，裂解量为26；Clark能裂解82.61%的结核分枝杆菌临床耐药株。噬菌体Sedeg噬菌斑圆形浑浊，边界模糊；Sedeg尾长233nm；最佳MOI为10-4；Sedeg感染宿主菌的潜伏期约为120min，裂解量为39；Sedeg能裂解52.17%的结核分枝杆菌临床耐药株。根据噬菌体基本生物学特性初步筛选出噬菌体D29、33D、TM4和Legendre作为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒疗法的候选噬菌体。2．采用鸟枪随机测序法对噬菌体33D测序，组装出一条长50036bp的线性双链DNA序列。采用glimmer在线分析软件分析，确定33D有84个推定基因。对这些基因进行逐个BLAST同源检索分析，得到17个已知功能的基因。gene6、gene7、gene8、gene9和gene14为噬菌体DNA复制相关基因；gene28（WhiB）为调节基因；gene47（Lysin B）和gene48（Lysin A）为裂解酶基因；gene57、 Gene59、gene60、gene61、gene64、gene70、gene74、gene75和gene76为噬菌体的结构基因。生物信息学分析确定噬菌体33D为裂解性噬菌体，33D噬菌体基因组无致病基因。采用鸟枪随机测序法对噬菌体Legendre测序，组装出一条长40733bp的线性双链DNA序列。采用glimmer在线分析软件分析，确定Legendre有58个推定基因。对这些基因进行逐个BLAST同源检索分析，得到19个已知功能的基因。gene25RDF、gene26（Repressor）和gene27（Integrase）编码与噬菌体溶源化相关的整合酶-阻遏蛋白系统；gene31（Lysin B）和gene32（Lysin A）为裂解酶基因；gene39、gene41、gene42、 gene43、gene44、gene45、gene46、gene52、gene53、gene56和gene57为噬菌体的结构基因。Legendre的gene26阻遏蛋白与噬菌体BPs、angle和Halo的编码阻遏蛋白的gene33完全一致，Legendre与噬菌体BPs、angle和Halo一样属于溶原性噬菌体，不能入选鸡尾酒疗法。3．噬菌体D29、33D和TM4对温度、紫外线、酸碱和酒精均敏感。与pH7.4的固体培养基比较培养基pH5时不会影响D29裂解宿主菌；虽然在pH5的环境中33D裂解宿主菌的能力严重受损，但是依然有部分噬菌体能裂解宿主菌；TM4在pH5培养基中不能侵染宿主菌形成噬菌斑。D29的K值为1070；33D的K值为704；TM4的K值为234。噬菌体D29、33D和TM4，TM4的抗原性最低。噬菌体D29、33D和TM4之间不存在交叉吸附表位，通过不同途径感染宿主。噬菌体鸡尾酒制剂（D29、33D和TM4）抑制耻垢分枝杆菌的能力明显强于单一噬菌体D29（P<0.05）；噬菌体鸡尾酒制剂（D29、33D和TM4）杀灭和抑制耐药结核分枝杆菌的能力明显强于单一噬菌体D29（P<0.05）。耻垢分枝杆菌对噬菌体鸡尾酒制剂（D29、33D和TM4）的耐药突变率为10-8明显低于对单一噬菌体D29的耐药突变率10-6。利用耻垢分枝杆菌mc2155无毒株作为保护载体（保护剂组），观察发现给药后1h和4h保护剂组的噬菌体在小鼠气管和肺部的滴度均明显高于裸噬菌体组（P<0.05）。表明在豚鼠体内耻垢分枝杆菌对噬菌体有显著的保护作用。4．过敏实验发现，第14天激发后粗制噬菌体组有两只豚鼠均出现不同程度的过敏现象；纯化噬菌体组豚鼠在第14天和第21天激发后均未出现任何过敏现象。热原检查实验发现，新西兰白兔在注射供试品（纯化噬菌体D29、33D和TM4）后体温无明显变化。通过荧光双标实验，激光共聚焦扫描显微镜观察发现噬菌体与巨噬细胞作用10min后被巨噬细胞吞噬，作用15min后巨噬细胞内形成少量噬菌体-吞噬溶酶体，作用20min后形成大量噬菌体-吞噬溶酶体，作用48h噬菌体完全被巨噬细胞清除。分别采用噬菌体鸡尾酒制剂（50μL/200μL）或生理盐水（50μL/200μL）滴鼻后，各组小鼠进食量、活动量基本正常。在暴露8周后,各组动物的体重无明显差异（P>0.05）。给药8周后，解剖小鼠，肉眼观察各组动物的脏器，肺脏、脾脏、肝脏均未见明显异常；在显微镜下观察肺脏、肝脏、脾脏的组织病理切片，均未见明显异常。结论分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂（D29、33D和TM4）具有比单一噬菌体（D29）更强的杀灭耐药结核分枝杆菌的能力；其导致的宿主菌耐药突变率更低；对受试动物无明显的毒副作用，安全性较好。分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂具有开发成为治疗耐药结核病药物的巨大潜力。本实验为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂开发成为新型的治疗耐药结核病药物提供实验依据，但是尚需进一步的动物体内研究支持。