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背景与目的胃癌的发病率在恶性肿瘤中位居第四位,仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌,是严重威胁我国人民生命健康的主要疾病之一,其发病机制迄今为止仍不明确。胃癌在发病早期症状不典型,部分患者就诊时已进入进展期。尽管在手术、化疗、放疗等方而取得了长足进步,但是进展期胃癌患者术后5年生存率仍无明显提高。大量研究表明,胃癌在发生、发展过程中有多种因素的参与,包括抑癌基因失活、癌基因突变、DNA损伤修复功能的降低、信号转导通路和凋亡过程的异常等,提示胃癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,可以负调节PI3K-Akt信号通路的信号转导,具有抑制细胞增殖和迁移以及促进凋亡的效应。PTEN基因的突变、缺失以及甲基化可以导致其抑癌功能丧失,引起肿瘤的发生。研究显示,胃癌组织中PTEN基因表达显著降低,并且PTEN蛋白表达水平与肿瘤大小、Borrmann分型、淋巴结转移和肿瘤分期呈负相关,表明PTEN基因失活可能是胃癌发生、发展的原因之一。Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins, IAP）家族新成员之一,它可以和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）直接结合而抑制细胞凋亡,进而起到促进肿瘤细胞生长的作用。研究发现Livin蛋白在包括胃癌在内的多种肿瘤组织中呈现高表达,沉默肿瘤细胞中Livin基因可以促进细胞凋亡、抑制肿瘤增殖。表明Livin的高表达与肿瘤的发生、发展及预后相关。本课题采用分子生物学技术,分别建立过表达PTEN基因、沉默Livin基因表达以及过表达PTEN同时沉默Livin基因表达的胃癌细胞株；通过在体和离体实验,观察调控PTEN和Livin基因表达对胃癌细胞生长、增殖、凋亡和迁移等方面的影响,为胃癌的治疗提供新的靶点和策略。课题共分三部分：第一部分,PTEN基因表达载体、Livin基因siRNA载体的构建和鉴定；第二部分,体外调控PTEN、Livin基因表达对胃癌BGC823细胞生物学行为的影响；第三部分,调控PTEN/Livin基因表达对裸鼠移植瘤生长的影响。第一部分PTEN基因表达载体、Livin基因siRNA载体的构建和鉴定方法设计带有EcoRI和SalI酶切位点的PTEN基因全编码区cDNA扩增引物；PCR扩增pCMV6-PTEN得到PTEN基因；扩增产物经EcoRI和SalI酶切后与表达载体pCL-neo重组；用EcoRI和salI双酶切鉴定转化重组子,并对重组子插入序列进行DNA序列分析,得到PTEN基因表达载体pCL-neo-PTEN。设计3个针对Livin基因的siRNA巴序列,合成发卡样DNA单链；退火成双链后与siRNA载体pRNAT-U6.1重组；用PCR扩增筛选转化重组于,DNA序列测定鉴定插入序列,得到3个针对Livin基因的siRNA载体。分别用脂质体LipofectamineTM2000包裹转染BGC823细胞,G418筛选得到对应的稳定转染细胞。采用荧光定量RT-PCR和Western-Blot分别检测转染的BGC823细胞Livin和PTEN mRNA和蛋白表达水平。结果1.PCR扩增得到1212bp的PTEN cDNA ORF区段目的基因；转化后得到多个重组子,经EcoRI/SalI双酶切和DNA测序鉴定证实获得的重组子pCL-neo-PTEN正确。2. RNAi Explorer和siDESIGN Center扫描人Livin cDNA编码序列（NM139317）,初步筛选得到50个侯选片段,经BLAST同源性分析,选择确定3个19个碱基的siRNA靶序列,分别为178-196位（GACCTAAAGACAG TGCCAA）、539-557位（GAGGTGCTTCTTCTGCTAT）、648-666（GGAAGAGACTTTGTCCACA）。3.双链发卡样DNA sil78、si539和si648与pRNAT-U6.1重组后,都得到多个重组子,PCR扩增筛选鉴定和DNA测序分析证实得到的阳性重组子pRNAT-U6.1-si178、pRNAT-U6.1-si539、pRNAT-U6.1-si648与设计完全一致。4.过表达PTEN组（转染pCL-neo-PTEN）、沉默Livin 1组（转染pRNAT-U6.1-sil78）、沉默Livin 2组（转染pRNAT-U6.1-si539）、沉默Livin3组（转染pRNAT-U6.1-si648）、空载体1组（转染pCL-neo）和空载体2组（转染pRNAT-U6.1）细胞经G418筛选3w,均得到稳定转染细胞株。5.与空白对照相比,空载体1组和空载体2组的Livin mRNA和蛋白表达水平无明显变化,差异无显著性（P>0.05）；与3个对照组比较,过表达PTEN组、沉默Livin 1组、沉默Livin 2组和沉默Livin3组细胞Livin mRNA和蛋白表达水平均显著降低,差异有显著性（P<0.05）,其中沉默Livin 2组的相对表达量最低。6.过表达PTEN组细胞的PTEN mRNA和蛋白表达水平显著高于其它各组（P<0.01）第二部分体外调控PTEN基因和Livin基因表达对胃癌BGC823细胞生物学行为的影响方法切下沉默Livin效果最佳siRNA载体中的Livin siRNA单元,重组入PTEN基因表达载体pCL-neo-PTEN,得到表达PTEN基因、同时沉默Livin基因的调控载体pCL-neo-PTEN-siLivin,用LipofectamineTM2000包裹,然后将其转染BGC823细胞,G418筛选得到过表达PTEN同时沉默Livin基因的稳定转染细胞。与第一部分获得的单一过表达PTEN的胃癌BGC823细胞株、单一沉默Livin表达的胃癌BGC823细胞株一起作为实验对象,采用RT-PCR和Western-blot测定各组细胞Livin和PTEN mRNA和蛋白表达水平、MTT方法检测细胞增殖、流式细胞法检测细胞周期和细胞凋亡、EILSA检测Caspase-3和Caspase-9蛋白酶活性、Transwell方法检测细胞侵袭转移能力。结果1. EcoRI酶切鉴定重组子,得到2个条带（3.4Kb和3.8Kb）,证实Livin siRNA单元成功插入；DNA序列测定确认得到阳性重组子。2.经G418筛选得到稳定转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞株。3.与空白对照组和空载体对照组比较,调控组（稳定转染pCL-neo-PTEN-siLivin的BGC823细胞）、沉默Livin组（稳定转染pRNAT-U6.1-siLivin的BGC823细胞）和过表达PTEN组（稳定转染pCL-neo-PTEN的BGC823细胞）的Livin mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）,其中调控组Livin mRNA和蛋白表达水平最低。4.与空白对照组和空载体对照组比较,过表达PTEN组和调控组细胞PTEN mRNA和蛋白表达水平显著升高,差异有显著性（P<0.01）。而过表达PTEN组和调控组细胞PTEN mRNA和蛋白表达水平无显著性差异（P>0.05）,说明在PTEN表达载体pCL-neo-PTEN中插入Livin siRNA单元不影响PTEN表达的水平。5.在3d、4d和5d MTT检测细胞,与空白对照组和空载体对照组比较,调控组细胞OD值显著降低,差异有显著性（P<0.05）。6.与空白对照组和空载体对照组比较,调控组、沉默Livin组和过表达PTEN组细胞的Caspase-3和Caspase-9活性显著升高,差异有显著性（P<0.05）,其中以调控组的提高更为显著。7.与空白对照组和空载体对照组比较,调控组、沉默Livin组和过表达PTEN组的细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。与沉默Livin组和过表达PTEN组比较,调控组细胞凋亡率明显升高,差异有显著性（P<0.05）。8.与空白对照组和空载体对照组比较,调控组、沉默Livin组和过表达PTEN组穿透Matrigel的平均细胞数显著降低（P<0.05）。与沉默Livin组和过表达PTEN组比较,调控组穿透Matrigel的平均细胞数明显减少,差异有显著性（P<0.05）。第三部分调控PTEN/Livin的基因表达对裸鼠移植瘤生长的影响方法取调控PTEN/Livin基因表达的胃癌BGC823细胞、过表达PTEN的胃癌BGC823细胞、沉默Livin表达的胃癌BGC823细胞、空载体对照的胃癌BGC823细胞和胃癌BGC823细胞,调整细胞浓度至1×108/ml,在裸鼠右侧腋部皮下接种0.1ml。在注射接种后的第7d开始测定绘制肿瘤生长曲线,第28天测量肿瘤大小后处死裸鼠,取肿瘤组织称重。荧光定量RT-PCR和Western-blot检测PTEN和Livin mRNA和蛋白表达水平。结果1.裸鼠皮下细胞接种7d后均出现可见肿瘤块形成；调控组、过表达PTEN组和沉默Livin组移植瘤生长速度明显慢于空白对照组和空载体对照组（P<0.05）。2.调控组移植瘤平均瘤重215.42±35.15mg、过表达PTEN组移植瘤平均瘤重461.73±58.17mg、沉默Livin组移植瘤平均瘤重368.23±53.72mg,均显著低于空白对照组和空载体对照组移植瘤平均瘤重（1051.29±175.95mg和968.88±194.39mg）,差异有显著性（P<0.05）,其中以调控组移植瘤平均瘤重最小。3.与空白对照组、空载体组和沉默Livin组比较,调控组、过表达PTEN组的PTEN mRNA和蛋白表达水平显著升高,差异有显著性（P<0.01）。与空白对照组、空载体组比较,调控组、沉默Livin组、过表达PTEN组的Livin mRNA和蛋白表达水平显著降低,差异有显著性（P<0.05）,其中以调控组最低。结论1.筛选得到过表达PTEN的胃癌BGC823细胞株、沉默Livin表达的胃癌BGC823细胞株和过表达PTEN同时又沉默Livin表达的胃癌BGC823细胞株。2.建立一种表达一个基因同时又沉默另一个基因的载体构建方法。3.过表达PTEN同时沉默Livin的调控可以有效抑制胃癌BGC823细胞的生长增殖、侵袭转移和促进细胞凋亡,比单一过表达PTEN或降低Livin表达的效果更为显著。4.在胃癌细胞中过表达PTEN同时沉默Livin的复合调控方法有可能成为胃癌治疗的有效策略。