肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica,SE)是一种兼性细胞内病原菌,能够引起多种动物发病。疫苗免疫是阻止SE进入食物链的一种有效方式,相对于灭活疫苗而言,弱毒疫苗对预防SE的肠道定植和全身性感染具有更好的效果。因此,研究一种安全、有效的疫苗是控制SE传播的首要任务。SE存在许多毒力相关基因,这些毒力相关基因的连锁作用,能够保证SE在营养缺乏的特殊宿主环境中生存并避免被宿主免疫系统清除。SE入侵宿主细胞是沙门氏菌感染的一个重要阶段,其入侵宿主细胞的过程需要侵袭基因的表达,hil A基因是对侵袭基因表达控制的一个主导者。环腺苷酸磷酸二酯酶(cpd B)基因可以水解细胞内第二信使(c AMP,环磷酸腺苷或c GMP,环磷酸鸟苷),从而终结这些第二信使所传导的对细胞活动有重要调节功能的生化作用。为了进一步致弱SE的毒力,本研究通过Red重组的方法,在本实验室已构建双基因缺失菌株SM6△cpx R/lon基础上,通过缺失hil A基因和cpd B基因构建了无抗性标记的三基因缺菌株SM6△cpx R/lon/hil A和四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B,对基因缺失菌株的生物学特性进行了初步研究,并开展了缺失株的致病性试验、免疫条件优化和免疫攻菌试验,为研究开发SE基因工程弱毒疫苗奠定了基础。本研究主要内容包括:(1)三基因缺失菌株和四基因缺失菌株的构建利用PCR技术扩增出两端与鸡肠炎沙门氏菌6(SM6)hil A基因上、下游同源臂且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,电击转化含有质粒p KD46的SM6△cpx R/lon中,获得替换hil A基因的阳性转化子(SM6△cpx R/lon△:hil A::Cat),再导入温度敏感质粒p CP20去除氯霉素抗性基因,通过PCR与序列测定鉴定,成功构建了hil A基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A,并以此为基础进一步缺失了cpd B基因,从而构建了四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B。(2)基因缺失菌株的生物学特性研究将获得的三基因缺失菌株和四基因缺失菌株在体外连续传代培养,通过PCR鉴定,表明三基因缺失菌株和四基因缺失菌株均能够稳定遗传。将野生株SM6、三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hil A/cpd B于LB培养基中增殖培养,绘制其生长曲线。结果表明,三基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A与亲本株SM6在体外增殖能力没有明显差异,而四基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的生长能力明显弱于三基因缺失株和亲本株,说明hil A基因的缺失没有影响细菌的生长速度与能力,而cpd B基因的缺失会对细菌的生长速度产生一定的影响。利用微生物鉴定系统,测定SM6、三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A和四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B对95种碳源的利用能力。结果表明,在碳源利用能力上,从四基因缺失菌株到三基因缺失菌株再到SM6亲本株依次减弱。(3)基因缺失株对雏鸡的致病性试验LD50试验结果表明,三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B LD50是SM6 LD50的215倍,四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B LD50是SM6 LD50的1931倍,三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A和四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的毒力均有所下降,四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的毒力下降了将近2000倍,对雏鸡的致病性明显低于SM6。三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A、四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B和SM6分别腹腔注射7日龄的SPF鸡,分别于注射后的第2天、第4天、一直到第12天无菌采取鸡的肝脏、脾脏和小肠,比较三个菌株在鸡体不同组织的定植情况。结果发现基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A和SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B在注射后的第10天在鸡的肝脏、脾脏和小肠只能分离到比较少的沙门氏菌,均显著低于(p<0.05)SM6在肝脏、脾脏和小肠的分离情况。基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A和SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B在鸡体内的定植情况均明显低于野生株SM6。(4)基因缺失株株对雏鸡的免疫保护试验通过对免疫途径和免疫剂量的摸索,制定了最佳的免疫程序。将64只7日龄SPF鸡共随机分为4组,即试验Ⅰ组(SM6△cpx R/lon/Hil A组,免疫剂量为1×108 CFU/m L)、试验Ⅱ组(SM6△cpx R/lon/Hil A/cpd B组,免疫剂量为1×109 CFU/mL)、试验Ⅲ组(灭活苗组)和对照组(PBS),每组16只。肌肉注射,共免疫3次,每次免疫间隔两周,一免后每周翅静脉采血,分离血清,间接ELISA方法检测血清Ig G。每次免疫后2周用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌情况,流式细胞仪检测CD4+及CD8+T细胞亚群动态变化,于第3次免疫后7天,以野生株SM6进行攻菌。攻菌1周后,剖杀未死亡鸡只,结合鸡的存活率和内脏病理变化,综合评价基因缺失株的免疫保护效果。试验结果表明,四基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B组和灭活苗组鸡的血清抗体水平明显高于三基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A组,且各试验组抗体水平均高于对照组,四基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B组和灭活苗组均能产生良好的体液免疫,且两组差异不明显。各个免疫组外周血IL-2、IL-6、IFN-γ均呈上升趋势,结合CD4+、CD8+T细胞亚群的动态变化,发现四基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B疫苗和三基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A疫苗均可以诱发良好的细胞免疫。攻菌后第7天,四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B在盲肠、肝脏和脾脏的荷菌数均低于三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A组和灭活苗组;从攻菌保护效果看,四基因缺失菌株和灭活苗组攻菌后鸡只均无明显的临床症状,好于三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A组,三基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A组中有3只鸡出现临床症状,对照组死亡2只,10只鸡出现了临床症状。表明四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B疫苗诱导的细胞免疫和体液免疫都处于较高水平,对沙门氏菌的攻击提供了很好的保护作用,本研究结果为鸡肠炎沙门氏菌新型疫苗的研制提供了基础。