人LIF基因的克隆、表达及功能研究

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目的:克隆人白血病抑制因子(LIF)基因,构建真核表达载体并进行表达,检测表达产物对HL-60白血病细胞的作用,同时观察经LIF基因修饰的ECV-304细胞对脐血造血干/祖细胞(HSC/HPC)体外培养的影响。 方法:采用RT-PCR技术克隆人LIF基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.0-LIF。经PCR、限制性内切酶双酶切鉴定和DNA测序正确后用脂质体转染法分别将pcDNA3.0-LIF真核表达质粒导入COS-7细胞和ECV-304人脐静脉内皮细胞,并通过G418筛选获得能稳定表达LIF的ECV-304转基因细胞。通过形态学观察、MTT、FCM法研究COS-7细胞表达产物对HL-60细胞的影响;通过激光扫描共聚焦显微镜、FCM、免疫细胞化学分析研究ECV-304转基因细胞稳定表达的rhLIF与IL-24基因在诱导HL-60细胞凋亡方面的协同作用;并用LIF基因修饰的ECV-304细胞与脐血CD34+细胞共培养,检测培养前后CD34+细胞及CD34+CD54+细胞数量的变化,观察转LIF基因的ECV-304细胞对脐血造血细胞的影响。 结果:成功获得609bp的编码人LIF蛋白的基因,序列测定结果与GenBank报道的LIF序列相比除有一个碱基发生同义突变外,其余均一致;pcDNA3.0-LIF真核重组表达质粒构建正确,人LIF基因可在COS-7和ECV-304两种细胞中进行有效表达;表达产物对HL-60白血病细胞具有较
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