水霉致病因子SpHtp1基因在不同种属水霉菌中的分布及环境因子对其表达量的影响

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水霉菌是一种丝状真菌,在分类地位上隶属于卵菌纲、水霉目、水霉科。作为卵菌纲动物病原菌,水霉菌适应性强,在地域及宿主选择上广泛,不仅能感染各种淡水鱼类,且能感染鱼卵。这种病原菌引起的症状主要表现在:在鱼体或鳍条上长有块状的白色或灰色丝状菌丝。SpHtp1基因在水霉感染宿主过程中起作用,该基因编码的蛋白具有RxLR结构,在感染宿主过程中减弱宿主免疫功能,从而增加病原菌的感染力。本研究鉴定了实验室分离纯化后的15株水霉,确定其种属;然后以水霉致病因子SpHtp1基因为对象,PCR检测该基因在实验室已鉴定的17株水霉菌株中的分布情况。同时,研究温度、盐度对SpHtp1基因在菌丝与孢子中的表达量的影响。本论文的主要研究结果如下:1)水霉菌株的鉴定研究通过形态学观察与比ITS区基因序列,鉴定菌株的种属。结果显示:实验室现有菌株大部分属于寄生水霉(Y7、O9、O10、O15、Y4、Y6、Y3)和多子水霉(O11、Y8、O12、O17),少数的南方水霉(O4)以及还不能确定种的水霉属菌株(Y1、Y5)。2)SpHtp1基因在不同种属水霉菌中的分布研究以GenBank中已知的SpHtp1(GenBank登录号:GU345745)的基因序列为基础,设计一对特异性引物,以ATCC200013TM的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,检测ATCC中的致病因子SpHtp1基因。以同样方法检测从广东、湖南、湖北等水霉病主要流行地区分离到的17株水霉菌中SpHtp1基因的情况,PCR扩增后,将扩增片段回收,并克隆入T载体,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆测序。将测序结果与GenBank中已知的SpHtp1基因序列进行比较,同源性为99%。结果发现:在17株水霉菌株中,有8株水霉菌检测到SpHtp1基因,阳性率为47%,且这8株含有SpHtp1基因的菌株在分类地位上均隶属于寄生水霉。3)环境因子(温度、盐度)对水霉SpHtp1基因表达量的影响以ATCC200013TM为研究对象,以20℃下无菌水培养的菌丝及孢子为标准,提取RNA、以反转录cDNA为模板,构建含有SpHtp1基因与内参基因SpTub-b片段的质粒作为标准品,制备标准曲线;利用荧光定量PCR方法研究不同温度(0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃)和盐度(0.12%、0.25%、0.5%、1%、2%)对ATCC200013TM水霉菌株菌丝与孢子中SpHtp1基因表达量的变化。结果表明:SpHtp1基因在水霉各生长阶段、各温度、盐度下中均有表达;表达存在显著差异。就温度而言,不同温度处理的水霉菌孢子与菌丝中SpHtp1基因的表达量均要低于在20℃时到达最大值;在15-30℃处理下的孢子及菌丝中的表达量要高于在0-10℃下处理的样品。且相同温度下,孢子中的表达量显著高于菌丝。对盐度而言,随着盐度的增加,孢子及菌丝中的SpHtp1基因表达量逐渐降低;相同盐度下,孢子中的表达量明显高于菌丝中的表达量。综述所述,SpHtp1基因在寄生水霉中普遍存在,且不对宿主及地域无严格选择性,在寄生水霉中特异存在。同时,环境因子(温度、盐度)对SpHtp1基因的表达有影响,在水霉适宜生长温度,低盐下表达量最大,且在孢子中的表达量显著高于在菌丝中的表达量。
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