第一部分 Egr-1在移植静脉再狭窄中的作用研究　　 动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种常见病、多发病，极易造成心、脑、肾、肢体等器官缺血，目前临床除降血脂外大多采取搭桥及血管成形术予以治疗。然而移植静脉再狭窄(Restenosis，Rs)是影响手术远期效果的最主要并发症。由于受到动脉化的血流动力学改变移植静脉发生血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell，VSMC)增殖、新内膜增生，并最终发生堵塞。目前其确切的发病机制并不十分明确，但近年来机械张力增加与移植静脉血管重构的相关研究越来越受到人们的关注。　　 Affymetrix gene array结果显示早期生长反应基因-1(Early growth responsegene1,Egr-1)是机械张力敏感性核转录因子。本课题旨在前期研究的基础上，从体内动静脉移植手术模型、体外机械张力刺激血管平滑肌细胞模型，探索Egr-1在移植静脉新内膜增生中的作用及可能的机制，为进一步阐明移植静脉再狭窄的分子机制提供依据。　　 一 Egr-1在静脉移植后新内膜增生中的作用　　 目的：　　 移植静脉再狭窄是以血管平滑肌细胞增殖为主的新内膜增生为主要病理特征。本实验通过建立小鼠下腔静脉-颈总动脉移植手术模型观察移植静脉新内膜增生和血管重构的病理改变。为进一步探讨Egr-1在移植静脉再狭窄中的作用，采用Egr-1基因敲除小鼠行静脉移植手术，观察Egr-1缺失对移植静脉新内膜增生和血管重构病变的影响。　　 方法：　　 建立同基因小鼠下腔静脉-颈动脉移植手术模型(vein graf，VG)。健康C57BL/6J小鼠和Egr-1基因敲除小鼠各36只，体重22-26g，28只造模，即野生型小鼠模型组(WT/VG)和Egr-1基因敲除小鼠模型组(Egr-1 KO/VG)；余下8做对照，即野生型对照组(WT)和Egr-1基因敲除小鼠对照组(Egr-1 KO)。术后24小时打开颈部皮肤，血流畅通者为模型组，继续饲养四周，血管颜色泛黑为手术失败。　　 实验结束时，麻醉小鼠，分离移植静脉；取部分标本行HE染色观察血管重构病变，并行免疫组化染色检测smooth muscleα actin(SMA)和IGF-IR的表达；其余标本冻于-80℃冰箱用作RNA检测；采用Real time PCR检测移植静脉Egr-1和IGF-1R mRNA的表达变化。　　 结果：　　 1、小鼠行静脉移植手术4周后，切片HE染色显示野生型小鼠模型组移植静脉壁明显增厚，血管口径缩窄；SMA免疫组化染色显示血管平滑肌细胞明显增生。这说明血管移植手术4周后移植静脉发生了明显的血管重构、新内膜增生。　　 2、免疫组化染色和Real time PCR检测到Egr-1和IGF-1R在移植静脉中表达增加。　　 3、HE染色和SMA染色显示，与野生型小鼠模型组相比Egr-1基因敲除小鼠血管移植后的静脉新内膜增生及血管平滑肌细胞增殖明显减弱。　　 4、免疫组化染色和Real time PCR显示，与野生型小鼠模型组相比Egr-1基因敲除小鼠移植静脉中IGF-1R的表达下降(53±6.8％ of WTNG，n=4，P<0.05)。　　 结论：　　 1、本实验通过复制小鼠静脉移植手术模型，观察到移植静脉血管重构伴明显的新内膜增生。　　 2、移植静脉中Egr-1和IGF-1R表达明显增加。　　 3、我们从整体水平证实Egr-1缺失明显逆转移植静脉的新内膜增生，并且Egr-1缺失后抑制IGF-1R表达增加。提示Egr-1可能通过调控下游生长因子信号通路参与血管移植后静脉重构的过程。　　 二 Egr-1在机械张力引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用　　 目的：　　 Egr-1是机械张力敏感的核转录因子，然而其在机械张力引起的的血管平滑肌细胞增殖中的作用尚不十分清楚。为进一步探讨Egr-1参与移植静脉新内膜增生的机制，本研究通过建立体外机械张力诱导血管平滑肌细胞增殖模型，观察机械张力对Egr-1表达变化的影响，并研究Egr-1缺失对机械张力刺激引起的血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制。　　 方法：　　 体外分离野生型小鼠和Egr-1基因敲除小鼠血管平滑肌细胞，运用FX-4000T细胞柔性基底应交加载系统，给细胞施以周期性张力牵伸，以模拟体内循环机械张力。分为野生型VSMC对照组(WT)；野生型VSMC+机械张力刺激组(WT/ST): Egr-1缺失VSMC对照组(Egr-1 KO)；Egr-1缺失VSMC+机械张力刺激组(Egr-1 KO/ST)。采用Real time PCR和Western blot方法测定细胞内Egr-1和IGF-1R的mRNA和蛋白表达变化。采用BrdU染色观察血管平滑肌细胞增殖情况。　　 结果：　　 1、机械张力处理血管平滑肌细胞30到60min即明显诱导Egr-1表达。　　 2、机械张力处理血管平滑肌细胞18h后，WT/ST组BrdU阳性细胞比率比WT组增加8.3倍，而Egr-1缺失后Egr-1KO/ST组BrdU阳性细胞比率降低(52.6±8.6％ of WT/ST，n=4，P<0.01)。　　 3、机械张力处理血管平滑肌细胞24h后，Egr-1KO/ST组IGF-1R蛋白表达下降(48±7％ of WT/ST，n=5，P<0.01)。　　 结论：　　 1、体外成功复制了机械张力刺激血管平滑肌细胞增殖模型。　　 2、机械张力刺激快速诱导血管平滑肌细胞Egr-1表达。　　 3、Egr-1缺失明显逆转机械张力刺激引起的血管平滑肌细胞增殖和IGF-1R表达上调。　　 三 Egr-1对机械张力激活IGF-1R转录的作用及分子机制　　 目的：　　 我们已经证实Egr-1在机械张力增加引起的血管平滑肌细胞增殖和移植静脉新内膜增生中起重要作用。然而Egr-1是否通过影响IGF-1R转录发挥作用尚不清楚。IGF-1R启动子区有多个Egr-1可能的结合位点，本实验目的在于探索Egr-1对IGF-1R转录调控的影响及机制，从而揭示Egr-1参与机械张力刺激引起的血管平滑肌细胞增殖及移植静脉再狭窄过程可能的分子机制。　　 方法：　　 1、采用IGF-1R启动子缺失突变及linker-scan突变质粒进行瞬时转染和荧光素酶活性分析，寻找对机械张力刺激敏感的IGF-1R启动子转录激活元件所在区域。　　 2、凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)观察机械张力刺激后核蛋白与IGF-1R启动子区的结合。　　 3、采用染色质免疫沉淀(ChIP)观察机械张力刺激诱导Egr-1与IGF-1R启动子区核心序列的结合。　　 结果：　　 1、机械张力刺激诱导IGF-1R启动子转录活性增强；IGF-1R启动子缺失突变分析显示(-270/-130)区是应答机械张力刺激的核心区域。　　 2、突变IGF-R启动子-170/-150或者-210/-190区使机械张力刺激IGF-1R启动子转录激活效应消失；在这两个关键区域分别有Egr-1的结合序列：(GCGGGGGCG，-196/-188)和(GCGGGCGCG，-162/-154)。　　 3、机械张力刺激血管平滑肌细胞30-60min后，核蛋白与IGF-1R启动子结合增加。　　 4、ChIP assay结果显示，机械张力刺激血管平滑肌细胞Egr-1与IGF-1R启动子特异性结合。　　 结论：　　 我们从体外分子水平证实，IGF-1R启动子(-170/-150)和(-210/-190)含有对机械张力刺激敏感的转录激活效应元件；机械张力刺激Egr-1特异性地结合到IGF-1R启动子核心序列区并激活其转录。　　 研究小结　　 本部分借助Egr-1基因敲除小鼠通过体内动静脉移植手术模型、体外机械张力刺激血管平滑肌细胞模型探讨了Egr-1在移植静脉再狭窄中的作用。并从体外证实机械张力刺激下Egr-1通过结合IGF-1R启动子核心序列激活其转录。这从分子水平证实Egr-1可能通过调控IGF-1R转录参与机械张力引起的血管平滑肌细胞增殖及移植静脉再狭窄的过程。　　 第二部分内皮脂肪酶在动脉粥样硬化中的表达研究　　 目的：　　 内皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)被证明是HDL代谢的关键酶，可能通过降解HDL参与动脉粥样硬化的发生发展。为进一步明确其在动脉粥样硬化中的表达调控，本实验借助大鼠高脂饮食诱导动脉粥样硬化模型和体外LPS刺激Raw264.7细胞模型探讨EL的表达变化及可能的机制。　　 方法：　　 建立高脂饮食诱导大鼠动脉粥样硬化模型。健康SD大鼠24只，体重200-220g，14只高脂饲料喂养，余下10正常饲料喂养做对照(CTL组)。12周实验结束时，抽血留做血脂检测。处死大鼠，分离主动脉弓至腹主动脉分叉处；取部分标本行HE染色和EL免疫组化染色；其余标本冻于-80℃冰箱用作蛋白和RNA检测；体外LPS刺激Raw264.7细胞检测EL和NFkB的表达，并研究PDTC(NFkB抑制剂)对LPS刺激EL的影响。　　 结论：　　 1、EL在大鼠动脉粥样硬化中表达增加。　　 2、体外LPS处理Raw264.7细胞后EL表达增加。　　 3、LPS可能是通过激活NFkB上调EL的表达。