目的：本课题为国家自然科学基金“脑微透析/激光散斑成像技术与PK/PD结合进行补阳还五汤“益气行血生新”机制的研究(No.81373973)”的部分内容。以黄芪、当归、地龙、赤芍、川芎、桃仁、红花为组方,进行实验用补阳还五注射剂的制备及含量测定方法的研究；以在体微透析采样考察补阳还五汤注射给药后的体内药动学,并进行不同剂量黄芪配伍组的药动学对比分析。考察不同缺血期再灌注过程对MCAO大鼠脑部血流的影响；在此基础上,考察给药后不同剂量益气组配伍的补阳还五汤注射后对不同损伤程度的MCAO大鼠的脑缺血再灌注保护作用,为探讨补阳还五汤治疗急性脑缺血中风的作用机理提供理论及实验依据。方法：1实验用补阳还五注射剂的制备1.1补阳还五汤益气方注射剂的制备建立黄芪中黄芪总皂苷的紫外分光光度法(UV-Vis)含量测定方法。采用静态及动态吸附实验筛选性能最佳的大孔吸附树脂；结合单因素试验、正交试验对纯化工艺进行优化,确定最佳的纯化方法；洗脱液经系列处理后制备成注射剂。1.2补阳还五汤活血方注射剂的制备建立活血方中川芎嗪(TMP)、阿魏酸(FA)的高效液相色谱法(HPLC)含量测定方法。选用FA、TMP作为综合判断指标,采用正交试验考察提取时间、提取次数和溶剂用量对提取工艺的影响。提取液经732阳离子树脂纯化除杂后,得到稳定的补阳还五汤活血方注射剂。2FA、TMP脑及血液探针体内外回收率的研究利用增量法及减量法分别考察影响FA、TMP微透析探针体外回收率的因素(流速、浓度、温度),并考察了探针回收率的日内重现性及探针植入动物体内后8h内的探针回收率稳定性。3UPLC-MS法补阳还五汤注射后大鼠脑局部及全身的药动学研究建立微透析液中FA、TMP的UPLC-MS含量测定方法；采用微透析技术进行静脉注射给药后补阳还五汤脑局部和全身的药动学研究,并进行不同剂量益气组配伍后的组间比较分析。采用PK Solver 2.0药动学软件计算药动学参数。4结合LSCI法补阳还五汤注射后对大鼠脑缺血再灌注的药效研究4.1 LSCI观测大鼠脑缺血再灌注方法的建立采用激光散斑成像方法(LSCI)探讨不同缺血期再灌注过程对MCAO大鼠脑部血流的影响,对低灌注状态、无复流现象、脑血流及管径的动态变化进行了观察及研究。4.2补阳还五汤的药效学研究采用改良Zea Longa线栓法制作大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型；研究不同黄芪配伍的补阳还五汤静脉给药后对不同损伤程度的MCAO模型大鼠的脑保护作用。采用LSCI对MCAO大鼠的脑局部血管管径、血流量进行实时监测,同时观察神经功能评分、脑梗塞体积(%)、脑含水量(%)变化的影响。结果：1实验用补阳还五注射剂的制备1.1补阳还五汤益气方注射剂的制备实验结果可知D101大孔吸附树脂对黄芪总皂苷的吸附能力及解吸附能力最好；正交试验结果表明：采用浓度为含生药0.06 g/mL黄芪提取液,最大上样量为1 BV,流速为3 BV/h,解吸附时用10 BV的70%乙醇解吸附,收集70%乙醇洗脱液,得纯化后的黄芪总皂苷提取物。按此方案进行了3批次药材的验证实验,黄芪总皂苷平均含量为279.16 mg, RSD=1.9%,说明此纯化工艺可行。将纯化的洗脱液经浓缩、萃取后合并,蒸干,残渣用适量注射用水溶解,定容,过滤,灭菌,冷藏备用。1.2补阳还五汤活血方注射剂的制备补阳还五汤活血方最佳提取工艺为：采用12倍量40%的乙醇作为提取溶剂,每次提取时间为1.5 h,共提取2次。提取液经732阳离子树脂纯化除杂后,合并洗脱液,浓缩,调节pH值,过滤,灭菌,冷藏备用。2FA、TMP脑及血液探针体内外回收率的研究两种浓度差法在影响因素相同的前提下测得的脑及血液微透析探针的体外回收率近似相等。当灌流液流速为1～2.5 μL/min, FA、TMP脑及血液探针体外回收率随着流速的增加而降低；当溶媒温度为25～42℃,脑及血液探针的回收率均随着温度上升而增加；提示可用反透析法校正脑及血液探针的体内回收率。脑及血液探针回收率分别在4个浓度梯度的循环中具体的变化趋势相似,提示探针回收率的日内重现性良好。此外,脑及血液探针在大鼠体内8h的体内回收率稳定性良好。3 UPLC-MS法补阳还五汤大鼠脑局部及全身的药动学研究建立UPLC-MS同时测定微透析液中FA、TMP的含量,结果显示,TMP浓度在7.71～771 ng/mL呈良好的线性关系,LLOQ为7.71 ng/mL; FA的线性范围为13.8-1380ng/mL, LLOQ为13.8ng/mL。方法的专属性、精密度、稳定性、基质效应考察均符合生物样品分析要求。结果表明补阳还五汤静脉给药后,FA、TMP能迅速通过血脑屏障,TMP在脑及血液中均呈二室开放模型：FA在脑及血液中均呈一室开放模型。与活血组对比,黄芪的增加能降低血液内TMP的t1/2,增加脑局部TMP的Cmax、AUC。黄芪剂量的增加还能延长FA在脑局部中的tl/2及MRT,增加脑内FA的Cmax、AUC,提示黄芪剂量的增加有利于维持脑局部FA较高的药物浓度及更为持久的作用时间。此外,黄芪剂量的增加还能够提高复方中FA的脑靶向效率。从药动学的角度看,说明补阳还五汤重用黄芪,辅以活血方的组方原理是科学、合理的。4结合LSCI法补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注的药效研究4.1 LSCI观测大鼠脑缺血再灌注方法的建立在2h的栓塞缺血后,大鼠脑部血流量约为栓塞前血流基值的46.68±3.16%,趋向于低灌注状态；随着缺血时间的延长,无复流现象加剧；再灌注期间,栓塞2h组的血流要比30 min组的低灌注水平低10%。4.2补阳还五汤的药效学研究与模型组对比,高剂量益气组配伍的补阳还五汤具有一定的脑保护作用,可明显降低脑缺血30 min组MCAO大鼠脑组织的脑梗死体积(%)及脑组织含水量(%),提高低灌注期间的脑血流量,作用效果与尼莫地平对照组相似；对脑缺血2h组MCAO大鼠的治疗效果则不明显。结论：本研究制备的实验用补阳还五注射剂,制备工艺可行,含量测定方法可靠,重现性好,能够满足本研究实验要求；在体微透析方法联合UPLC-MS法可应用于补阳还五汤注射给药后的脑局部及全身药动学研究,益气组配伍剂量的增加能延长FA在脑局部中的t1/2、MRT;增加TMP、FA脑局部Cmax、AUC,有利于提高复方中FA的脑靶向效率,体现了原方重用黄芪的组方合理性。引入LSCI法定量评价脑栓塞缺血再灌注过程脑损伤程度,实验表明：补阳还五汤具有脑缺血再灌注保护的药理作用,高剂量黄芪的补阳还五汤组对由短期脑缺血再灌注过程导致的脑损伤具有一定的脑保护作用,印证了补阳还五汤中重用黄芪,佐以活血组,共奏补气活血通络之功的“益气行血”中医组方理论的合理性。