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目的:支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia, BPD)是严重影响儿童生活质量的一种慢性肺疾病(Chronic lung disease, CLD),死亡率极高,存活者常伴有明显肺发育障碍和肺功能低下。目前国际上对 BPD 的发病机制尚不清楚,但大量研究显示其病因与高氧肺损伤引起的肺泡炎性水肿过程密切相关,预示肺液体的转运调节机制可能参与了 BPD 的发生、发展进程。水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是一种特异性对水主动转运的膜蛋白,是组织液体转运中一个重要的调节因子,它可能通过对肺组织中水转运的调节而影响肺的发育成熟过程。本研究以胎鼠、新生鼠、幼鼠到成年鼠四个不同年龄段大鼠为研究对象,通过动态观察肺组织中4种主要AQPs的基因及其蛋白在细胞膜上的表达和定位;以及几个肺组织发育成熟相关指标的变化,分析它们间的变化趋势和相关性,以探讨 AQPs 在肺组织发育成熟过程中的表达和意义。 方法:取四组清洁型 Wistar 大鼠:孕 20 天胎鼠(E20,21 天足月)重庆医科大学研究生学位论文 -.3.-组、7 天新生鼠组、1 月幼鼠组和成年鼠组,每组 8 只。采用免疫组织化学方法(SABC)观察 AQP1、AQP3、AQP4、AQP5 在各组肺组织细胞膜上的定位和含量变化;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定AQP1、AQP3、AQP4、AQP5 mRNA 在肺组织的表达。此外对肺组织成熟指标(蛋白质、DNA 含量,肺含水量(湿/干重比 W/D))以及肺组织形态学改变也进行了相关分析。结果:1、形态学观察显示随着大鼠年龄的不断增长,肺实质成分不断增多分化,肺泡和血管结构不断完善,表现为动态的连续发育过程。肺组织中蛋白质和 DNA 含量逐渐增加,连续不断,从胎鼠到新生鼠期增长最快,以后增速减慢。肺含水量(W/D 比)在胎鼠时很高,出生后一周内迅速减少至成年水平,E20 组分别与 7d、1m 和 Adult 组比较均有显著性差异(P<0.01),而 7d、1m 和 Adult 组间两两比较均无显著性差异(P>0.1)。2、免疫组化表明:AQP1 在孕 20 天(E20)时有少许表达,出生后迅速达高峰,并维持在高表达水平至成年期;而 AQP3、AQP4 和 AQP5在 E20 天时均没有出现表达,出生后都迅速增加,呈增量表达至成年期。AQP1 主要表达在肺组织间质,大部分分布在肺血管内皮细胞和间质细胞细胞膜;AQP3 主要表达在支气管上皮细胞基质膜;AQP4 主要表达在大、小气道上皮细胞基质膜;AQP5 主要表达在肺泡Ⅰ型上皮细胞顶膜面和粘膜下腺体的腺上皮细胞上。3、RT-PCR 揭示:AQP1 mRNA 在 E20 时已经开始表达,新生鼠期重庆医科大学研究生学位论文 -.4.-增加 3 倍左右,以后维持在高表达水平进入成年期;AQP3 和 AQP4 出生前仅有微弱的表达,出生后有所增加,随年龄的变化呈线性趋势增长;AQP5 出生前也有微弱表达,至新生鼠期增加了近 10 倍,随年龄的增长呈数倍的增速进入成年期。AQP1、AQP3、AQP4、AQP5 mRNA 相对含量分别在四个年龄组间两两比较均有显著性差异(P<0.01)。4、AQPs mRNA 表达与肺组织发育成熟有关指标的相关性分析显示:随着年龄的增长,AQP1 分别与肺蛋白质和 DNA 含量变化趋势的相关系数为 0.976 和 0.979;AQP3 为 0.988 和 0.99;AQP4 为 0.995 和0.997;AQP5 与他们的相关系数各自为 0.98 和 0.99。结果表明 AQPs的含量变化与肺组织中蛋白质和 DNA 的生理学变化趋势有很好的一致性,它们之间存在高度正相关。肺组织含水量在 E20 天时很高,出生后迅速减少至成年水平,然而此时四种 AQPs 基因及蛋白质表达正处于增长高峰,说明围生期肺液体的快速清除与 AQPs 的增量表达有关。结论:1、肺组织发育从胎鼠、新生鼠、幼鼠至成年鼠,其生长连续不断,呈现一个动态的发育成熟过程,其中胎鼠至新生鼠期增长最快,之后增速减慢。肺含水量在胎鼠期很高,围生期迅速降低至成年水平,这与其适应生后肺生理功能变化有关。2、AQPs 的表达与肺发育过程中主要的生理学变化趋势高度相关,说明 AQPs 参与了肺组织发育成熟的生理过程,其中 AQP1 可能起主要作用。3、根据 AQPs 表达部位和量的变化,推测 AQPs 参与了围生期肺重庆医科大学研究生学位论文 -.5.-内液体的快速清除过程、为新生儿迅速建立与外界的气体交换创造了条件;AQP1、AQP5 与出生后远端肺液体转运有关;AQP3 和 AQP4 可能参与了气道表面的液体调节和气体湿化、AQP5 参与了肺腺体的分泌过程。关键词:水通道蛋白,组织发育,肺成熟,相关性重庆医科大学研究生学位论文 -.6.-第二部分高浓度氧和地塞米松对肺组织中水通道蛋白-1 表达的影响目的:支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia, BPD)是机械通气治疗新生儿呼吸窘迫综合症(Neonatal respiratory distresssyndrome, NRDS)时可能出现的严重并发症,目前认为其发病和高氧肺损伤有关,临床上尚无确切有效的防治方法。地塞米松是一种糖皮质激素,广泛应用于肺部炎症性疾病,防止或减轻肺纤维化形成,促进肺组织成熟,是治疗 BPD 的常用药物,其作用机制尚未完全阐明。有迹象表明,糖皮质激素可能通过对肺组织中 AQPs 表达的影响而起到了减轻或防治肺损伤的作用。本部分研究拟将新生一天大鼠