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转移与复发已成为肝细胞癌(HCC)病人术后生存的主要障碍,研究与肝癌细胞侵袭、转移相关的分子靶点对预防HCC术后复发、提高疗效有重要意义。RhoC是ras基因超家族的一个成员,参与细胞信号的转导及细胞骨架的重建。已有的研究表明,RhoC基因的过量表达与肿瘤转移密切相关,在肿瘤转移过程中可能起到类似“开关”基因的作用。然而,能否通过下调RhoC的表达水平来抑制肝癌的侵袭与转移目前尚不清楚,我们推测,以RhoC为靶点的基因治疗对预防肝癌术后复发转移有一定意义。目的:构建RhoC-siRNA表达载体并将之稳定转染入肝癌细胞中以建立RhoC基因“敲弱”(knockdown)的细胞模型,在此基础上,探讨RhoC-siRNA对肝癌细胞侵袭转移潜能的影响作用,为肝癌的基因治疗提供新的靶点和实验资料。方法:(1)利用生物信息学技术在线设计特异性RhoC-siRNA,在体外构建和克隆RhoC-siRNA表达载体(pSilencer2.1-RhoC-siRNA);(2)将RhoC-siRNA表达载体及阴性对照载体(pSilencer2.1-HK)分别转染入SK-Hep1肝癌细胞中,通过G418筛选,建立稳定转染的细胞模型,分别命名为SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞及SK-Hep1/HK细胞;(2)Western-Blot法检测SK-Hep1、SK-Hep1/HK及SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞中RhoC蛋白的表达水平,鉴定RhoC-siRNA表达载体的功能;(4)体外实验:倒置显微镜下及细胞爬片HE染色观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞粘附率,细胞划痕法检测细胞迁移能力,Boyden小室法检测细胞侵袭性;ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF的含量;(5)建立人肝癌裸鼠皮下种植瘤模型,观察三组细胞在裸鼠体内生长及转移情况。主要结果:(1)酶切鉴定及测序证实RhoC-siRNA表达载体构建成功。(2)与SK-Hep1及SK-Hep1/HK细胞相比,SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞中RhoC蛋白表达水平下降约60%;(3)SK-Hep1、SK-Hep1/HK及SK-Hep1/RhoC-siRNA三组细胞在细胞形态及生长方式上差别不明显;(4)SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞和SK-Hep1/HK细胞的增殖滞后于SK-Hep1细胞,以培养第4～5天差别较明显(p<0.05),但SK-Hep1/HK细胞和SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞在增殖曲线方面差别不显著(p>0.05);(5)细胞接种20min、40min、60min后,SK-Hep1细胞组在Matrigel基质上的粘附率分别为(38.1±10.37)%、(68.4±11.52)%、(85.1±8.38)%,SK-Hep1/HK细胞组的粘附率分别为(34.3±9.56)%、(62.5±12.31)%、(80.6±9.43)%,SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞组的粘附率分别为(31.2±7.10)%、(57.2±8.08)%、(71.5±4.19)%,SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞组在Matrigel基质上的粘附率低于前2组,于接种后60min时有显著差异(p<0.05);(6)划痕48h后,SK-Hep1细胞组及SK-Hep1/HK细胞组划痕区已基本长满,而SK-Hep1/ RhoC-siRNA细胞组划痕依然明显,提示RhoC-siRNA可抑制SK-Hep1肝癌细胞的迁移能力;(7)接种16h后,SK-Hep1细胞及SK-Hep1/HK细胞侵袭到Boyden小室下室面的细胞数分别为146±26.8和129±19.0,两组无显著性差异(p>0.05),SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞组的侵袭细胞数为67±18.5,较前两组明显降低(p <0.05);(8)培养24h后,SK-Hep1细胞组及SK-Hep1/HK细胞组培养上清液中VEGF的含量分别为141.7±24.1pg/105细胞和134.6±16.1pg/105细胞(p>0.05),SK-Hep1/RhoC -siRNA细胞组的VEGF的分泌量为91.2±13.7pg/105细胞,较前2组显著降低(p <0.01);(9)SK-Hep1细胞及SK-Hep1/HK细胞于接种后第5天即可成瘤,且生长速度快,瘤体体积大,SK-Hep1/RhoC-siRNA细胞组于接种后第8天成瘤,其瘤体体积明显小于前2组(p <0.01)。结论:(1)本研究成功地构建了RhoC-siRNA真核表达载体,将之转移到SK-Hep1细胞中可有效降低RhoC蛋白的表达水平,蛋白抑制率达60%;(2)RhoC-siRNA对SK-Hep1细胞的形态、生长方式及增殖能力无显著影响,但可明显抑制其在细胞外基质上的粘附率、向划痕损伤区的运动能力和体外侵袭能力,并能减少SK-Hep1细胞分泌VEGF的水平,同时,RhoC-siRNA表达载体转染的SK-Hep1细胞在裸鼠体内的生长受到抑制;(3)RhoC-siRNA可抑制SK-Hep1肝癌细胞的侵袭转移潜能,以RhoC为靶点的基因干预可部分逆转肝癌细胞的恶性侵袭表型,对防止肝癌转移复发具有一定的临床意义。