论文部分内容阅读
曼氏无针乌贼有很高的经济价值和营养价值，其墨汁也有很好的药用价值。但由于过渡捕捞及生态环境污染，曼氏无针乌贼资源遇到危机，人工养殖及放流可更好地保护渔业资源。但人工养殖和野生状态下，曼氏无针乌贼的成长状况及营养均有明显差异，其墨汁成分是否有差别尚未有报道，因此本研究比较了野生和养殖乌贼墨汁的差异。黑色素的生物学功能，如在抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等方面已有许多报道，但其分子机制尚不明确，本研究通过非编码RNA芯片分析及生物信息学分析，确定曼氏无针乌贼墨汁黑色素在抗氧化衰老过程中的差异表达mRNA和非编码RNA，分析黑色素对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用机制。 采集野生和养殖曼氏无针乌贼的墨汁，通过测定营养元素、氨基酸、脂肪等方法分析二者的差别。用酶解法从墨汁里提取黑色素，构建动物衰老模型，并灌胃黑色素，通过miRNA和lncRNA芯片，检测和分析空白对照组（CONT）、衰老模型组（MD）、黑色素组（HS）的miRNA和lncRNA表达谱，以差异倍数大于等于2且p小于等于0.05的标准，筛选出具有差异表达的miRNA和lncRNA。通过生物信息学分析，预测lncRNA的靶基因、生物学功能聚类及信号通路。利用皮尔森相关系数预测lncRNA的靶基因并构建lncRNA-mRNA共表达网络。通过生物信息学分析预测miRNA的靶基因、生物学功能聚类及信号通路。构建H2O2诱导的NIH-3T3衰老细胞模型，确定miRNA在抗氧化衰老过程中的作用。双荧光素酶报告基因实验确定miRNA的靶基因。采用qPCR验证在黑色素组和衰老模型组具有代表性差异表达的miRNA和lncRNA。 野生和养殖乌贼墨汁的粗蛋白质、粗脂肪的营养成分差异不显著，必需氨基酸和其他一些氨基酸的含量有明显差异。lncRNA和mRNA芯片显示，CONT和MD存在38个显著差异的lncRNA分子，其中20个上调，18个下调，有49个差异的mRNA分子，其中上调的mRNA有30个，下调的mRNA有19个；HS和MD存在110个显著差异的lncRNA分子，其中73个上调，37个下调，有221个差异的mRNA分子，其中上调的mRNA有133个，下调的mRNA有88个。在HS和MD组，首先选取差异显著上调FR153817、FR018037、FR401328和FR400831和显著下调FR289706、FR344660、XR_168903.1和ENSMUST00000146928逐一分析其共表达靶基因、GO和KEGG。整体差异lncRNA的GO和KEGG分析及cis调控结果显示，曼氏无针乌贼墨汁黑色素对生物钟节律、糖代谢、脂代谢、解毒等方面发挥重要作用。miRNA芯片显示，CONT和MD存在9个显著差异的miRNA分子，其中2个上调，7个下调；HS和MD存在8个显著差异的miRNA分子，其中1个上调，7个下调。通过细胞实验，确定miR-320、miR-1971、miR-342、miR-697、miR-350在黑色素的抗衰老过程中发挥生物功能。通过双荧光素酶报告基因实验，miR-697靶向结合GPT2的3’UTR区，促进丙氨酸和丙酮酸的可逆转氨基，对D-半乳糖造成的糖、脂、蛋白代谢紊乱起到一定的缓和作用。荧光定量实验，验证了lncRNA和miRNA在组织中的差异表达与芯片结果相一致。 本研究探索了编码RNA和非编码RNA在黑色素抗衰老过程中是否有参与，发现了差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA。通过生物学分析及细胞实验，发现黑色素的生物功能主要是对生物钟节律、糖代谢、脂代谢及解毒方面具有重要影响，有助于后续实验研究详细分析黑色素的分子作用机制，也可为抗衰老方面的用药或治疗提供指导作用。