绪论以原位灭活肿瘤细胞、消除肿瘤负荷为目的的热物理治疗由于针对性强、创伤小、疗效确切等优点,在肿瘤治疗中引起广泛关注。然而单独的热疗或冷疗也都有其局限性,冷疗后消融区域复发率较高,冷冻范围过大会引起“冷休克”现象;热疗区域血流灌注量较大,使热量被削弱而影响治疗,血流加快还会带来转移的危险。为了克服单冷和单热治疗的缺陷,同时发挥各自的优点,有研究提出了冷热交替的治疗方法,先冷冻肿瘤可破坏肿瘤及其周边的血管,增强热消融的疗效,并且冷冻将肿瘤限制在一定区域内,降温杀伤作用后,再予以加热,产生剧烈的热应力可强化杀灭肿瘤的效果,还能有效防止肿瘤扩散。但冷热交替治疗在肝肿瘤中的研究还未见报道,本文采用冷热交替治疗系统,对兔VX2肝肿瘤进行冷热交替消融,应用超声造影及增强CT随访观察其疗效,并初步探讨了其抗肿瘤生物学效应,为冷热交替治疗在肝肿瘤中的应用奠定实验基础。第一部分 冷热交替治疗系统对正常兔肝消融效果的实验研究目的探讨安全有效的冷热交替治疗方式及评价其消融效果的影像学方法,为冷热交替治疗活体肝肿瘤提供实验依据。方法采用冷热交替治疗系统,设置不同的边缘临界温度,对正常新西兰大白兔肝脏进行单独冷冻、单独加热和冷热交替消融,即刻观察消融效果,比较兔肝消融灶的病理学变化,得出在有效消融肝组织条件下能最大限度保护周围肝实质的消融方式,并在此条件下对兔肝进行冷热交替消融,消融后1天、3天、7天和14天进行超声和CT检查,观察消融灶影像学的动态表现,并分别于不同时间点处死兔子,取出肝脏,对消融灶进行HE染色,将大体病理消融灶的测量结果与超声造影、增强CT测量结果进行比较。结果单独冷冻、单独加热和冷热交替消融可引起不同程度的肝细胞变性、消融灶充血出血表现,冷热交替组肝细胞碎裂、变性,消融区出血淤血更严重,不同边缘临界温度对消融范围和消融效果有影响,冷冻温度越低、加热温度越高,消融区范围越大,组织消融效果越明显。温和的冷热交替模式(0℃/43℃)安全有效,消融灶中心凝固性坏死,消融后1天和3天,坏死灶周围可见组织充血水肿和急性炎细胞浸润,CT平扫为低或等密度灶,常规超声为低回声为主的混合回声区,增强CT和超声造影均表现为无灌注区和动脉期周边环状增强。消融后7天和14天,消融灶周围组织充血水肿好转,有纤维组织增生、慢性炎细胞浸润及钙化形成,增强CT和超声造影表现为环形强化逐渐减轻消失,消融灶缩小。超声造影和增强CT可以清晰地显示肝脏消融灶的形态和范围,其对消融灶的测量结果与病理标本比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。结论冷热交替消融较单独冷冻或单独加热对肝组织的损伤更明显,温和的冷热交替消融(0℃/43℃)能产生有效的凝固坏死灶,增强CT和超声造影能有效反映不同时期肝脏冷热交替消融灶的演变,准确显示消融灶的范围。第二部分 冷热交替治疗兔VX2肝肿瘤的疗效观察及影像学评价目的观察冷热交替消融对兔VX2肝肿瘤的治疗效果,并探讨超声造影和增强CT在评价其疗效方面的作用。方法采用肿瘤组织块包埋法建立兔VX2肝肿瘤模型,用超声观察兔VX2肝肿瘤的生长,种植后16天,将荷瘤兔随机分为冷热交替治疗组和对照组,每组10只。治疗后随访6个月观察两组动物的生存期及生存率,并于治疗后1天、7天、14天和30天行CT和US检查,观察肝肿瘤冷热交替治疗后影像学特征并测量消融灶大小,评价病灶的消融效果。如随访期内出现动物死亡,立即进行尸体解剖以判断死因,至第6个月末处死所有动物明确治疗结果。结果冷热交替治疗组荷瘤兔6个月内的平均生存时间为156.5天,一般情况良好,体重逐渐增加(P<0.05)。对照组荷瘤兔的平均生存时间为59.7天,均因肿瘤进展在随访期内死亡。70%(7/10)的治疗组荷瘤兔肿瘤完全消融,治疗后1天,消融灶体积较术前肿瘤病灶明显增大,后逐渐缩小(P<0.05),生存到第六个月末,且没有出现局部复发和转移。对照组荷瘤兔都出现肿瘤转移,而冷热交替治疗组仅30%(3/10)的荷瘤兔出现转移,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比较,冷热交替治疗能抑制肿瘤的生长,延长动物生存时间(P<0.05)。完全消融的肿瘤增强CT和超声造影显示病灶内无强化,2例消融不完全的残留灶在增强CT和超声造影上可见结节状或不规则厚环状异常强化。结论冷热交替治疗可以抑制兔VX2肝肿瘤生长和转移,延长荷瘤兔的生存期,是有效的肿瘤治疗手段。超声造影和增强CT可以有效地评价其消融效果,及时发现残存肿瘤,二者具有良好的诊断一致性,并各有优势,超声造影因其实时动态成像等优点,在肝肿瘤冷热交替消融后的疗效评价中具有潜在优势。第三部分 冷热交替治疗抗肿瘤生物学效应的实验研究目的探讨冷热交替治疗对兔VX2肝肿瘤的生物学作用。方法将36只荷瘤兔随机分为两组,即冷热交替治疗组和荷瘤对照组。对兔VX2肝肿瘤进行冷热交替治疗,分别在治疗前及治疗后即刻、1天、3天、7天和14天处死动物,每组各时间点各处死3只兔,对病灶进行HE染色及TUNEL染色,并采用免疫组化分析法测定HSP70表达,光镜下观察消融灶内肿瘤细胞坏死、凋亡及HSP70的表达情况。结果HE染色显示冷热交替治疗后即刻消融灶内肿瘤细胞坏死,消融区充血出血明显,但消融区内仍有肿瘤细胞存活,治疗后1天和3天,肿瘤坏死范围逐渐增大,肿瘤细胞变小、变少,核分裂相减少,肿瘤细胞趋向死亡,消融区边缘有急性炎性表现,中性粒细胞浸润,消融区靠近肝脏处胆管增生、肝细胞再生、纤维结缔组织增生,治疗后7天和14天,消融区坏死更加明显,消融区内有慢性炎症表现,多核巨细胞、淋巴细胞浸润,钙化形成。TUNEL染色肿瘤细胞凋亡主要位于消融灶边缘,治疗后即刻消融区细胞凋亡不明显,治疗后1天肿瘤细胞凋亡明显,凋亡指数达峰值,细胞有明显的棕褐色深染,治疗后3天,消融灶内仍可见较多凋亡细胞,至治疗后14天,消融灶内凋亡细胞逐渐减少。治疗后即刻,肿瘤细胞核HSP70表达强阳性,1天以后,细胞核表达急剧减少,细胞质表达弱阳性,并逐渐增多,至治疗后7天,胞质表达明显增多,治疗后14天,消融区内HSP70表达减少。结论冷热交替治疗兔VX2肝肿瘤,导致肿瘤组织坏死,除了具有较强的肿瘤直接杀伤作用,还可以引起消融区炎症反应,诱导肿瘤细胞凋亡并且可以增加消融区HSP70的表达。