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目的:多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种浆细胞克隆性异常增殖的恶性血液肿瘤,仍无法治愈。近年来,沙利度胺、雷利度胺、硼替佐米等靶向治疗的药物为MM的治疗带来了可喜的进展。其中硼替佐米作为一种蛋白酶体抑制剂,治疗初治或复发难治性MM患者的地位均已受到了肯定。如何更好地发挥硼替佐米在MM中的治疗作用,更多的研究在进行中。研究表明,硼替佐米与多种化疗药物联合,具有协同抗细胞凋亡作用,提高了多发性骨髓瘤治疗的总体有效率,且耐受性较好。同时,还发现硼替佐米诱导细胞凋亡新的分子学基础和作用机理,为硼替佐米在治疗其他恶性肿瘤提供了理论基础。本实验以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,比较硼替佐米联合组蛋白去乙酰酶抑制剂丙戊酸钠诱导RPMI8226细胞凋亡与单用硼替佐米或丙戊酸钠诱导细胞凋亡的效应,并初步探讨两药联合协同诱导细胞凋亡的机制。方法:1 RPMI8226细胞的培养和传代人类多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226,培养于含体积分数为20%的灭活胎牛血清（FBS）、100U/ml的青霉素和100μg/ml的硫酸链霉素、10mmol/L的HEPES液的RPMI1640培养液中,置37℃、体积分数为5%的二氧化碳的培养中培养,每2～3天传代一次,实验取对数生长期细胞。2 MTT法检测生长抑制率取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为6×104/ml,接种于96孔平底培养板,分别加入不同浓度的硼替佐米,不同浓度的丙戊酸钠,或硼替佐米联合不同浓度的丙戊酸钠。孵育不同时间后每孔加入20μl MTT,离心吸除上清,加入200μl DMSO,震荡溶解还原的紫色结晶,酶标仪570nm处测吸光度A值,计算细胞生长抑制率。3流式细胞仪检测细胞凋亡率取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为2×105/ml,接种于6孔培养板中,每孔5ml,分别加入硼替佐米、硼替佐米联合不同浓度丙戊酸钠,对照组加入等量的PBS,孵育48h后离心收集细胞,4℃PBS洗涤2遍,将细胞重悬于200μl Binging Buffer,并加入10μl Annexin-FITC,轻轻混匀,室温避光反应15min后,加入300μl Binging Buffer和5μl PI,轻轻混匀后立即在流式细胞仪上检测,计数104个细胞,CELLQuest软件分析细胞凋亡率。4 HDACⅠ表达的检测取经不同浓度硼替佐米、丙戊酸钠、硼替佐米联合丙戊酸钠处理48h后细胞,提取总RNA。取提取物测OD260/OD280。RNA电泳检测RNA完整性。逆转录合成cDNA。以β-actin表达量作为内对照,RT-PCR检测不同培养条件下HDACⅠ表达的变化。5统计学分析SPSS18.0软件分析,数据以均数±标准差表示,相关样本非参数方差分析,P<0.05表示差异有显著性,P>0.05为差异无显著性。结果:1硼替佐米、丙戊酸钠抑制RPMI8226细胞株的增殖,呈时间剂量依赖性。硼替佐米浓度分别为10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L、40nmol/L,24h的细胞增殖抑制率为3.1%、7.37%、12.37%、17.88%;48h的细胞增殖抑制率为4.92%、27.28%、37.69%、41.91%;72h的细胞增殖抑制率为14.6%、41.92%、59.14%、64.02%。丙戊酸钠浓度分别为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L,24h、48h和72h的细胞增殖抑制率分别为:0.37%、5.78%、17.02%、24.76%;10.67%、15.03%、24.16%、43.21%;25.16%、32.32%、42.53%、59.65%。硼替佐米（20nmol/L）联合丙戊酸钠（1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L）处理细胞24h、48h、72h后的生长抑制率为14.38%、22.06%、24.98%、34.25%;34.63%、44.61%、55.74%、64.63%;45.84%、50.44%、57.19%、63.86%。根据金（正均）氏公式计算Q值得出两药在丙戊酸钠浓度≤4mmol/L,作用48h内具有协同作用。2 AnnexinV/PI双染检测法检测细胞凋亡率结果显示,终浓度为20nmol/L的硼替佐米联合终浓度分别为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L的丙戊酸钠作用于RPMI8226细胞48h后细胞,细胞凋亡率呈剂量依赖性增加。凋亡率由50.16±2.94%增加65.70±2.27%,明显高于单用硼替佐米（20nmol/L）组（P<0.05）。3 RT-PCR结果显示硼替佐米可下调HDACⅠ的表达,与硼替佐米的作用浓度和时间相关。硼替佐米与丙戊酸钠联合后降低HDACⅠ的表达比单用丙戊酸钠的明显。结论:1硼替佐米与丙戊酸钠可抑制RPMI8226细胞的增殖,呈时间剂量依赖性。2硼替佐米与丙戊酸钠联合能增强对RPMI8226细胞的增殖抑制和诱导凋亡,与单用硼替佐米或丙戊酸钠相比,两药联合具有协同作用。3硼替佐米可以下调HDACⅠ的表达,这可能是硼替佐米联合丙戊酸钠协同抑制RPMI8226细胞增殖和诱导RPMI8226细胞凋亡的机制。