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目的:课题组前期研究发现,干细胞标志物CD44、CD117、CD133以及胚胎干细胞标志物Oct4等在早期小鼠卵巢表面上皮(Mouse Ovarian Surface Epithelial,MOSE)细胞存在表达,并且阳性率随着MOSE细胞体外传代次数的增加而增加,细胞自我更新能力增强,表明肿瘤干细胞样细胞特性的获得参与了MOSE细胞自发恶性转化的过程。进一步研究发现维生素D可以通过抑制EMT过程延缓MOSE细胞的恶性转化过程。2013年《Nature Medicine》报道,在卵巢门部位的表面上皮细胞中存在干细胞生龛(niche),参与卵巢表面上皮细胞的损伤修复,并且可能是上皮型卵巢癌的起源。我们知道90%的卵巢癌属于上皮型卵巢癌,而且大多数卵巢癌患者被诊断时已处于晚期。由于其对抗肿瘤药物不敏感等特性而易复发和转移。目前关于上皮型卵巢癌复发和转移的假说认为,在卵巢癌中存在的一种异质性强且具有干细胞特性的小群体细胞,称之为肿瘤干细胞(cancer stem-like cells,CSCs)。这种肿瘤干细胞可能来源于Wnt/β-catenin信号通路调节紊乱的成体干细胞。另外,耐药基因ABCG2在干细胞群体中过表达,可以泵出外来物如Hoechst 33342。因此,本研究使用流式细胞术,从晚期已发生恶性转化的MOSE细胞(MOSE cells in late,M-L)中分选侧群(Side Population,SP)细胞,与非侧群细胞(non-side population,NSP)相比较,研究SP细胞是否具有肿瘤干细胞样特性,并且观察活性维生素D对SP细胞干细胞特性的影响及其可能机制。为后续深入探索卵巢癌肿瘤干细胞的特性及寻找消灭肿瘤干细胞的方法提供可靠的实验研究资料。方法:本研究分为三个部分。(1)分离和鉴定卵巢癌干细胞样细胞:利用分选流式细胞仪,从M-L细胞中分选SP细胞。使用无血清的干细胞培养基悬浮培养,以富集并扩增SP细胞。使用悬浮球成球率、限制性稀释实验检测细胞自我更新能力,分析SP细胞干细胞标志物和多能干性相关基因的表达情况,比较SP细胞和NSP细胞在X射线和重粒子照射后存活曲线的差异,并且通过裸鼠体内成瘤实验判定SP细胞的致瘤性,评价SP细胞是否具有肿瘤干细胞的相关特性。(2)维生素D对SP细胞的作用:与未处理的sp细胞相比较,观察活性维生素d(1?,25dehydroxyvitamind,1α,25(oh)2d3)处理组sp细胞悬浮球成球率、abcg2基因表达、干细胞标志物、多潜能干性相关基因表达以及细胞周期等变化,检测1α,25(oh)2d3是否可以提高sp细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性,通过体外matrigel实验和体内裸鼠致瘤性实验,综合分析1α,25(oh)2d3对sp细胞干细胞特性的影响。(3)1α,25(oh)2d3在卵巢癌干细胞样细胞中潜在的作用靶点:与对照组sp细胞相比较,检测1α,25(oh)2d3处理后sp细胞中β-catenin、c-myc、cyclind1和dkk-1等基因和蛋白表达的变化;并分析维生素d受体(vitamindreceptor,vdr)、活性维生素d降解酶cyp24a1以及活化酶cyp27b1等基因的表达变化,初步探讨活性维生素d对卵巢癌干细胞中潜在的作用靶点,为探索其发生机制提供研究基础结果:(1)分离和鉴定卵巢癌干细胞样细胞:使用分选流式细胞仪从已发生恶性转化的小鼠卵巢表面上皮细胞(m-l)中分选sp细胞,经过体外无血清的干细胞培养基悬浮培养,sp细胞悬浮成球生长,悬浮球规则圆整,生长缓慢,逐步传代培养过程中,弃去贴壁生长的细胞,提高sp细胞的纯度。而nsp细胞初步培养时有少量悬浮球,但悬浮球不规则,最后均贴壁生长;悬浮球成球率的实验结果显示,各代sp细胞的悬浮球成球率均高于nsp细胞(p<0.05);限制性稀释实验表明,形成一个肿瘤球只需要5.54个sp细胞,说明sp细胞的自我更新能力高;sp细胞的干细胞标志物(cd44和cd133)以及多能干性相关基因(sox2、klf4、notch1和notch2)的表达均高于nsp细胞;real-timeq-pcr结果显示,sp细胞耐药基因abcg2的表达量约为nsp细胞的3倍(p<0.05),提示sp细胞可能表现为较强的耐药性;x射线照射及重粒子辐照实验结果显示,在相同剂量照射下,当使用悬浮球形成率检测存活曲线时,sp细胞的存活率明显高于m-l和nsp细胞,说明sp细胞对x射线和100let的重粒子均具有较强的辐射抗性;皮下移植瘤的实验显示,sp细胞具有明显地致瘤性,而nsp细胞在整个观察期内均未见裸鼠形成肿瘤。卵巢原位移植瘤的实验显示,sp细胞和nsp细胞原位接种都有致瘤性。病理切片结果显示,sp组皮下肿瘤组织中可见血管形成和多核细胞,原位肿瘤组织中细胞形态各异,异质性强。以上实验结果表明,sp细胞具有肿瘤干细胞的相关特征,可以作为本研究分选肿瘤干细胞样细胞的一种可行方法。(2)维生素d对sp细胞肿瘤干细胞特性的影响:分选的sp细胞在体外悬浮培养过程中加入10nm的1?,25(oh)2d3连续处理4代,发现sp细胞的悬浮球成球率降低、悬浮球的直径明显变小。说明维生素d可能抑制卵巢癌干细胞的自我更新能力;细胞周期分析结果显示,1?,25(oh)2d3并没有增加sp细胞中g0/g1期比例,处理前后sp细胞g0/g1期比例分别为57.95%、58.93%。说明,活性维生素d抑制卵巢癌干细胞的悬浮球成球率,可能与g0/g1期阻滞无关。细胞凋亡的实验结果显示,与紫杉醇单独作用组相比较,1?,25(oh)2d3和紫杉醇联合干预组sp细胞的凋亡并没有增加说明,1?,25(oh)2d3不能增强紫杉醇对卵巢癌干细胞的促凋亡作用。real-timeq-pcr的实验结果表明,1?,25(oh)2d3处理sp细胞后,abcg2的表达无明显变化(p>0.05),这也可能与1?,25(oh)2d3微弱的促凋亡作用有关。而real-timeq-pcr结果显示,干细胞标志物cd133mrna的表达升高(p<0.05),但多能干性相关基因sox2的表达明显下降(p<0.05),1?,25(oh)2d3对sp细胞干性的影响可能与sox2有关。将sp细胞接种于matrigel中,模拟体内致瘤性,实验结果显示,1?,25(oh)2d3虽然促进了sp细胞50μm以下悬浮球成球率,但是抑制50μm以上悬浮球的成球率,对100μm以上的悬浮球并无影响。说明活性维生素d可以抑制sp细胞的锚着独立生长能力。裸鼠体内成瘤实验结果显示,皮下注射sp细胞的裸鼠中,接种103和104个sp细胞组的成瘤数均为1,肿瘤潜伏期为30d,恶病质发生于接种后58d,肿瘤组织中可见血管形成。维生素d3处理的皮下注射sp细胞裸鼠中,103和104个sp细胞接种量的成瘤数虽然也均为1个,但是,肿瘤潜伏期延长为45d,恶病质发生于接种后68d,而肿瘤组织中血管形成减少,异质性降低。皮下致瘤实验结果表明,维生素d延缓了卵巢癌干细胞的成瘤时间及恶病质进程。溶剂注射对照组的裸鼠,在原位注射sp细胞后第36d时,疑似恶病质体征,在卵巢部位发现白色结节,重量(包括卵巢)约为0.0563g,腹腔内无腹水;而维生素d3注射组的裸鼠,在手术后第36d时,体重减轻,无法进食,疑似恶病质体征,但解剖发现腹腔内无腹水和肿瘤的形成。检测各组血清25(oh)d的水平,结果发现1000iu/w的维生素d3注射剂处理后裸鼠血清中的25(oh)d,相对于各非维生素d3注射组高,且具有统计学意义(p<0.05)。说明,维生素d干预可以提高裸鼠血清25(oh)d水平,这可能是与其延缓卵巢癌干细胞所致的成瘤时间及恶病质有关。(3)1α,25(OH)2D3对SP细胞VDR/β-catenin通路中相关分子表达的影响:Real-time Q-PCR结果中显示,与对照组SP细胞相比较,1?,25(OH)2D3处理SP细胞3代后,β-catenin、DKK-1和CyclinD1等表达没有明显变化,而c-Myc的表达却升高。Western Blot实验结果显示,1?,25(OH)2D3处理并没有影响SP细胞β-catenin和CyclinD1的表达。维生素D代谢相关分子的实验结果发现,1?,25(OH)2D3处理后的SP细胞VDR mRNA的表达较低,但是活性维生素D降解酶CYP24A1在1?,25(OH)2D3诱导下mRNA的表达量升高达70万倍(P<0.05),说明急剧增高的CYP24A1可能降解1?,25(OH)2D3,使其有效剂量减少;另外,低表达的VDR也可能导致SP细胞对1?,25(OH)2D3的反应迟钝。结论:1.本实验分选的SP细胞具有卵巢癌干细胞相关特性,可以作为肿瘤干细胞样细胞的可靠模型;2.活性维生素D影响SP细胞的自我更新能力可能与下调Sox2表达有关;维生素D3干预可以延长裸鼠体内SP细胞致瘤的潜伏期,以及带瘤生存时间;3.SP细胞VDR低水平表达,以及活性维生素D处理后其降解酶CYP24A1剧增可能是活性维生素D对SP细胞VDR/?-cantenin信号通路作用微弱的关键原因。