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多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是来源于终末分化的B淋巴细胞的恶性肿瘤,在造血系统肿瘤中占10%,占全部恶性肿瘤的1%,属于中老年性疾病。多发性骨髓瘤以骨髓中浆细胞的克隆性增生,血清或尿液中出现单克隆免疫球蛋白或其成分(M蛋白),正常免疫球蛋白受到抑制以及广泛溶骨病变和/或骨质疏松为特征。多发性骨髓瘤存在多步骤、多阶段的复杂发病机制,近年主要集中在细胞遗传学异常、骨髓微环境与骨髓瘤细胞相互作用、NF-κB及Notch信号通路和耐药机制几方面。造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干/祖细胞在骨髓定居、增殖、分化、发育和成熟的场所,是支持和调节造血细胞生长发育的内环境;另一方面,造血微环境也在血液病的发生、发展,血液肿瘤细胞增殖、凋亡等病理生理过程中发挥重要作用。研究证实,多发性骨髓瘤细胞的发病及瘤细胞的增殖、分化、凋亡与造血微环境尤为密切。而骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作为造血微环境的主要成份和功能单位,通过与肿瘤细胞的直接粘附和分泌多种细胞因子影响骨髓瘤细胞生长、生存、耐药和迁移。150年来,从马法兰的引入到大剂量化疗联合造血干细胞移植,虽使MM治疗的有效率和完全缓解率有所提高,但复发率仍然很高,目前MM仍是一种不能治愈的疾病。近年随着基因芯片和蛋白组学等生物技术的发展,学者们对MM提出更侧重于微环境和细胞因子网络的靶向治疗。越来越多的研究表明,通过改造骨髓瘤细胞赖以生存的病态骨髓造血微环境有利于瘤细胞的清除。那么能否采用非骨髓来源的基质细胞替代病态造血微环境以促进骨髓瘤细胞的清除呢?研究表明,从肝脏、肺脏、胸腺及皮肤等组织来源的基质细胞尚不能达到理想的体外HIM模型的功能。我室在前期研究工作中在国内外首先发现和证实了脐血中存在有基质细胞的前体细胞,并经体外培养扩增获得人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs),证明其具备造血基质细胞的基本特征和造血调控的物质基础,得到了国际同行认可。我们在前期研究工作中将人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株分别与hUCBDSCs和正常人BMSCs共培养,结果发现hUCBDSCs-HIM具有较hBMSCs-HIM对Jurkat细胞更强的抑制增殖作用和促凋亡现象。相比白血病,多发性骨髓瘤的发生发展更依赖于病态的造血微环境,那么体外用hUCBDSCs-HIM代替患者的病态BMSCs-HIM,对骨髓瘤细胞的增殖和凋亡是否会有类似的效应呢?为了初步探讨体外hUCBDSCs-HIM对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的作用,本课题在构建骨髓瘤KM3细胞/hUCBDSCs共培养模型的基础上,体外观察hUCBDSCs对多发性骨髓瘤细胞抑制增殖和促凋亡的作用。从IL-6/IL-6R途径、NF-κB及其调控基因途径两个方面深入探讨体外hUCBDSCs对骨髓瘤细胞抑制增殖和促凋亡的可能机制,为促进骨髓瘤细胞的清除,提供新的辅助治疗措施。方法:1.人脐血源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞抑制增殖和促凋亡的体外研究实验分组:①KM3细胞悬浮培养组;②KM3细胞/hUCBDSCs共培养组;③KM3细胞/MM-BMSCs共培养组。倒置显微镜和扫描电镜观察KM3细胞和基质细胞的位相关系;CCK8法绘制KM3细胞生长曲线;流式细胞仪检测KM3细胞的细胞周期和凋亡情况,透射电镜观察KM3细胞超微结构。2. IL-6/IL-6R途径在人脐血源基质细胞抑制骨髓瘤KM3细胞增殖中的作用ELISA法检测共培养前后KM3细胞、hUCBDSCs和MM-BMSCs培养上清IL-6和sIL-6R浓度;激光共聚焦、流式细胞仪检测不同培养条件下KM3细胞IL-6R蛋白表达,real time PCR检测KM3细胞IL-6R mRNA表达水平。3. NF-κB途径在人脐血源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞抑制增殖和促凋亡中的作用3.1人脐血源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞NF-κB活化的抑制作用EMSA法、激光共聚焦显微镜检测不同培养条件下KM3细胞NF-κB活化情况, Western blot法检测KM3细胞IκBα表达水平。3.2人脐血源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞NF-κB靶基因的抑制作用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜检测不同培养条件下KM3细胞ICAM-1蛋白表达,real timePCR检测KM3细胞ICAM-1 mRNA表达水平。Western blot、激光共聚焦显微镜检测不同培养条件下KM3细胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达,real timePCR检测KM3细胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表达水平。结果:1.倒置显微镜观察,KM3细胞呈球形,粘附在hUCBDSCs表面,随培养时间的延长,KM3细胞数量逐渐增多;扫描电镜观察发现KM3细胞可通过伪足粘附于hUCBDSCs表层,或龛于hUCBDSCs融合所形成的“网眼”中,部分hUCBDSCs胞膜突起与多个KM3细胞粘附,形成“放射状”排列。KM3细胞生长曲线显示KM3/hUCBDSCs组KM3细胞增殖最慢;细胞周期结果显示KM3/hUCBDSCs组S期细胞比例最高,G2/M期比例最低,显示hUCBDSCs共培养组KM3细胞阻滞于S期。凋亡率结果显示KM3/hUCBDSCs组KM3细胞凋亡率最高,死亡率无显著差异。2. IL-6/IL-6R途径在人脐血源基质细胞抑制骨髓瘤KM3细胞增殖的中的作用ELISA检测结果显示hUCBDSCs也分泌IL-6,并且共培养后KM3细胞可以刺激hUCBDSCs分泌IL-6;但无论是共培养前还是共培养后IL-6的表达水平均明显低于MM-BMSCs分泌IL-6水平。ELISA法检测共培养前后KM3细胞分泌sIL-6R的水平,显示与hUCBDSCs共培养后KM3细胞分泌sIL-6R的水平下降地更明显;流式细胞仪检测也显示与hUCBDSCs共培养后KM3细胞mIL-6R表达的阳性率下降得更明显;real time PCR检测不同培养条件下KM3细胞IL-6R mRNA表达情况,结果显示与hUCBDSCs共培养后KM3细胞IL-6R mRNA表达最低。3. NF-κB途径在人脐血源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞抑制增殖和促凋亡中的作用3.1 EMSA法和激光共聚焦显微镜检测结果显示与hUCBDSCs共培养后KM3细胞NF-κB的活性最低,NF-κB在部分KM3细胞胞浆高表达、胞核不表达或低表达;Western blot检测显示hUCBDSCs共培养组KM3细胞IκBα蛋白的表达明显增强。3.2流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测显示与hUCBDSCs共培养的KM3细胞ICAM-1蛋白表达平均荧光强度明显减弱,MM-BMSCs共培养组KM3细胞ICAM-1表达明显增强,且可在部分KM3细胞胞浆中发现红色点状荧光;real time PCR检测不同培养条件下KM3细胞ICAM-1 mRNA表达情况,与hUCBDSCs共培养后KM3细胞ICAM-1 mRNA表达最低。Western blot和激光共聚焦显微镜检测显示与hUCBDSCs共培养的KM3细胞Bcl-2、Bcl-XL表达明显减弱,MM-BMSCs共培养组KM3细胞Bcl-2、Bcl-XL表达明显增强;real time PCR检测不同培养条件下KM3细胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表达情况,与hUCBDSCs共培养后KM3细胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表达最低。结论:1.人脐血源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用:①生长曲线――细胞扩增速度受抑;②细胞周期――S期细胞比例明显增多,但G2/M期细胞比例减少,细胞周期阻滞于S期;③扫描电镜――可见KM3通过伪足粘附、龛合于hUCBDSCs细胞;④凋亡率:凋亡率增加;透射电镜――可见凋亡和死亡细胞。2. hUCBDSCs可以分泌IL-6并且骨髓瘤KM3细胞也可促进其分泌IL-6;hUCBDSCs构成的新型造血微环境IL-6的表达水平显著低于MM-BMSCs的病态肿瘤微环境。3. hUCBDSCs通过下调KM3细胞IL-6R的表达,抑制了骨髓瘤KM3细胞的增殖。4. hUCBDSCs通过抑制骨髓瘤KM3细胞NF-кB的活化,下调靶基因ICAM-1、Bcl-2和Bcl-XL基因转录,抑制骨髓瘤细胞粘附的功能和减少抗凋亡蛋白的表达,导致骨髓瘤KM3细胞增殖减低、凋亡增加。