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1.该实验以中国近交系五指山小型猪(WZSP)和微型白猪为材料,先后从27头猪采集了312枚早期胎儿用于进行猪胚胎干细胞(EG)建系影响因素研究,得出如下结论:(1)d26-28猪胎儿可用于制作胎儿成纤维细胞.制作饲养层时,STO、MEF<1>细胞用10μg/mL丝裂酶素C处理1.75h~2h;PEF细胞用丝裂酶素C处理2.25h~2.5h.(2)分别收集d27 WZSP和微型白猪胎儿,实验结果证明,WZSP和微型白猪在EG细胞培养方面没有显著性差异(P>0.05),都可以用来作为EG细胞建系的材料.(3)分别采用d26、d27、d28胎儿,在相同条件下培养,实验结果证明,d26、d27、d28胎儿PGC细胞培养效果差异不显著(P>0.05).(4)采集d27胚胎,分别放在两种培养液中培养[培养液1:DMEM(丙酮酸钠)+15％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％MEM-非必需氨基酸+1％Penicillin-Streptomycin+10μMβ-巯基乙醇;培养液2:DMEM(丙酮酸钠):HF10(v:v=50:50)+15％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％MEM-非必需氨基酸+1％Penicillin-Streptomycin+10μMβ-巯基乙醇+1000IU/mL LIF+40ng/mL SCF+20ng/mL bFGF],结果证明两种培养液培养PGC细胞效果差异不显著(P>0.05).(5)用不同饲养层培养PGC,实验结果证明PGC在新鲜制作的STO和MEF<1>饲养层上,可以得到传3代以上的EG集落;PGC在铺有解冻的STO饲养层细胞、PEF或丝裂霉素C处理过的PEF、涂有0.1％明胶的4孔板上,一直没有得到典型的EG集落.(6)用两种方法从生殖嵴获得PGC细胞:a,机械分离;b,化学消化+机械分离.结果证明两种PGC采集方式培养效果没有显著差异(P>0.05);比较了一个胎儿的PGC接种1、2、3、4个培养孔(4孔板),结果证明接种密度以1个胎儿接种2-3个培养孔的密度比较合适.(7)对非饲养层培养系统培养猪PGC进行了初步探索.实验结果证明,以STO为饲养层,培养液中加条件培养基对猪EG细胞保持不分化状态有积极作用,但培养板底铺有STO基质或明胶,即使用条件培养基也没有获得典型的EG集落.(8)以STO细胞为饲养层,培养液中加否生长因子对EG培养效果影响不大(P>0.05),但培养液中加入生长因子后,对EG细胞培养传代更有利.而培养板底只铺有0.1％的明胶时,即使培养液中加入生长因子也没有形成典型的EG集落.(9)对原代出现的EG集落分别在不同时间传代,实验结果证明,在原代出现大批EG集落的(以出现大批EG集落的当天为第1天,d1)第2(d2)、3(d3)、4(d4)天传代效果好;对原代出现的EG集落分别采用三种消化方式传代:a,消化液1(0.2％Trypsion-0.04％EDTA)+一次离散法;b,消化液2(含0.1％鸡血清的消化液1)+一次离散法;c,消化液2+连续离散法.实验结果证明,用a、b、c三种方式传代原代EG集落后都能形成新的大量EG集落.2.将新鲜和培养24h的PGC、6代前的EG细胞进行显微注射.从42头供体猪获得564枚胚胎.419枚胚胎注射PGC/EG细胞,与未注射的145枚胚胎搭配混合后分别移植给22头受体猪.其中3头妊娠,一头(移植注射第2代EG细胞胚胎)妊娠后来终止;一头产下10头白猪仔(移植注射新鲜PGC细胞胚胎);另一头(移植注射第6代EG细胞胚胎)产下8头猪仔,其中2头经皮肤色素和分子遗传学鉴定证明为嵌合体猪.这是中国首例获得的EG细胞嵌合体猪.(P<0.05)