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高频电磁场(High-frequency electromagnetic field ; HF-EMF)指频率在100kHz-300MHz的电磁辐射,HF-EMF在鞋业的高频胶合、塑料行业的塑料热合、机械行业的淬火金属熔炼、电子行业的显像管制造过程中相当常见,国内外流行病学调查和动物实验证明,生殖系统是电磁辐射损伤的主要靶器官[1],HF-EMF是电磁辐射的一种。由于女性的一些特殊的解剖、生理特点,很容易受到多种因素的影响,但许多研究由于频率不同,剂量不同,结果也各异[5]。而且有关这些生殖健康损伤作用机制的研究也尚缺乏较深入的研究。本项目研究通过现场劳动卫生学与流行病学调查,并结合动物实验研究,探讨HF-EMF女(雌)性性腺毒性作用、卵巢细胞凋亡分子机制以及大豆异黄酮(SIF)对HF-EMF女(雌)性性腺毒性的保护效应,为HF-EMF健康危害的预防控制提供科学依据。一、HF-EMF女(雌)性性腺毒性研究目的:研究职业暴露HF-EMF对鞋厂女工月经状况与妊娠结局及性激素水平的影响,及短期和亚慢性暴露HF-EMF对雌性大鼠动情周期、卵巢病理改变及性激素的影响,探讨HF-EMF女(雌)性性腺毒性作用。方法:1.采用分层随机抽样方法,问卷调查某市区暴露HF-EMF 1年以上鞋业女工180名及同一社区日用品超市身体健康女工349名的月经状况与妊娠结局情况;随机抽取暴露组与对照组女工(处排卵期)各30人,静脉采血,制备血清并采用放射免疫法测定E2、P4、FSH和LH激素水平。2.短期动物实验:选用清洁级Wistar雌性大鼠60只,按体重分层随机分为5组,动情间期开始暴露辐射,暴露剂量分别为(0;25;100;400;1600V/m),每天8小时,连续3天后取卵巢,检测性激素、各级卵泡数目构成比和卵巢细胞超微结构等。3.亚慢性动物实验:选用清洁级Wistar雌性大鼠60只,按体重随机分为5组,辐射剂量同上,全身暴露HF-EMF8小时/天,每周连续5天,停2天,共暴露8周,第48天开始观察大鼠动情周期的变化。暴露结束后待大鼠处于动情期时取血清和卵巢,检测性激素、卵巢湿重及脏器系数、各级卵泡数目构成比和卵巢细胞超微结构等。结果:1.人群调查结果:HF-EMF暴露组女工月经紊乱发生率显著高于对照组(P<0.01);高暴露组女工月经经量异常发生率显著高于对照组(P<0.05);各暴露组孕激素水平均显著低于对照组(P<0.01)。2.短期动物实验结果:100V/m组卵巢黄体数目构成比显著高于对照组(P<0.05),400V/m组和1600V/m组黄体数目构成比显著低于对照组(P<0.05),1600V/m组的成熟卵泡构成比显著低于对照组(P<0.01),1600V/m组的原始卵泡显著高于对照组(P<0.01),初/次级卵泡和闭锁卵泡构成比各剂量组比较差异无统汁学意义;各剂量暴露组P4水平均显著高于对照组(P<0.01),1600V/m组E2水平显著高于对照组(P<0.01),25V/m组与100V/m组LH水平显著高于对照组(P<0.05),400V/m组与1600V/m组LH水平显著低于对照组(P<0.05)。透射电镜观察各剂量组卵巢生殖细胞超微结构的改变不大。3.亚慢性暴露实验结果:各剂量组大鼠体重与卵巢湿重及脏器系数的比较差异无统计学意义;100V/m组、400V/m组、1600V/m组大鼠动情前期时间显著短于对照组(P<0.01),400V/m组、1600V/m组大鼠动情间期时间显著长于对照组(P<0.01);400V/m组、1600V/m组黄体数目构成比显著高于对照组,100V/m组、400V/m组、1600V/m组闭锁卵泡数目构成比显著高于对照组,而成熟卵泡和初/次级卵泡数目构成比显著低于对照组;400V/m组、1600暴露组的LH激素水平显著高于对照组(P<0.01),而E2激素水平显著低于对照组(P<0.01);随辐射剂量的增大,细胞超微结构改变越明显,细胞核染色质成块,核仁边集,甚至出现核固缩、凋亡小体,线粒体出现肿胀、水肿,甚至空泡状。二、HF-EMF诱导雌性大鼠卵巢细胞凋亡及其机制的研究目的:研究短期和亚慢性暴露HF-EMF对雌性大鼠卵巢生殖细胞凋亡的诱导作用,探讨亚慢性暴露HF-EMF诱导卵巢细胞凋亡的相关机制。方法:短期和亚慢性动物模型同前。用DeadEndTM荧光法TUNEL系统检测卵巢各类细胞凋亡数,用RT-PCR检测卵巢组织Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3等mRNA的表达,用Western-blot方法检测Bcl-2、Fas、Bax等蛋白水平。结果:1.短期暴露HF-EMF,卵巢细胞凋亡率各组间的比较差异无统计学意义。2.亚慢性暴露HF-EMF,随辐射剂量的增大,黄体颗粒细胞和间质细胞凋亡率均显著增加(P<0.01),生长卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡各剂量组比较差异无统汁学意义。3.亚慢性暴露各剂量组及对照组卵巢组织均有Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等mRNA及Bcl-2、Fas、Bax等蛋白表达;与对照组比较,各剂量组卵巢组织Caspase-3 mRNA与Bax蛋白表达水平显著增高(P<0.01);100V/m组、400V/m组、1600V/m组卵巢组织Caspase-9 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01);Caspase-8 mRNA与Fas蛋白表达水平无明显变化。三、SIF对HF-EMF女(雌)性性腺毒性保护效应的实验研究目的:研究SIF对亚慢性暴露HF-EMF女(雌)性性腺毒性的保护效应,初步探讨SIF对HF-EMF女(雌)性性腺毒性的保护效应机制。方法:选用清洁级Wistar雌性大鼠60只,每只大鼠每天在辐射前用SIF(150mg/Kg·d)灌胃,建立亚慢性暴露HF-EMF动物模型(同前)。检测动情周期、性激素、各等级卵泡数目构成比、卵巢生殖细胞超微结构、卵巢细胞凋亡、卵巢组织Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3等mRNA的表达及Bcl-2、Fas、Bax等蛋白水平。结果:1.与E0组比较,大鼠卵巢湿重及脏器系数各组间比较差异无无统计学意义;E1600组动情间期时间显著延长(P<0.01);E1600组黄体数目构成比显著上升(P<0.01),初/次级卵泡、成熟卵泡构成比显著下降(P<0.01),E400、E1600组闭锁卵泡构成比显著上升(P<0.01);E1600组的LH激素水平显著增加(P<0.01),FSH、E2与P4激素水平各剂量组比较差异无统计学意义;E100、E400、E1600组的细胞超微结构出现不同程度的改变。与单纯辐射组比较,E100、E400组动情前期时间明显增加,而E100、E400组的动情间期时间则明显缩短;E400组的黄体数目构成比明显下降(P<0.05)而初/次级卵泡构成比明显上升(P<0.05);E100、E400组的E2水平明显升高(P<0.01)而LH水平明显下降(P<0.01);E25、E100、E400组的细胞超微结构有明显改善,E1600组细胞超微结构变化不明显。2.与E0组比较,E400、E1600组的黄体颗粒细胞凋亡率和E25-E1600组的间质细胞凋亡率均显著增加(P<0.01),与单纯辐射组比较,黄体颗粒细胞凋亡率和间质细胞凋亡率有下降趋势,其中E100、E400组黄体颗粒细胞凋亡率显著低于单纯100、400辐射组(P<0.01);E25-E400组间质细胞凋亡率显著低于单纯25-400辐射组(P<0.01),差异有统计学意义;各组卵巢组织均有Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等mRNA及Bcl-2、Fas、Bax等蛋白表达,与E0比较,各组卵巢组织Caspase-3 mRNA与Bax蛋白表达水平显著高于E0组(P<0.01) ; E1600组卵巢组织Caspase-8、Caspase-9mRNA与Fas蛋白表达水平均显著高于E0组(P<0.01);E400、E1600组的大鼠卵巢组织Bcl-2蛋白表达水平显著低于E0组(P<0.01);但与单纯辐射组比较,Fas蛋白与Caspase-8mRNA表达水平变化不明显,各组Bcl-2蛋白表达水平出现明显上调,Bax蛋白与Caspase-9mRNA表达水平出现明显下调。结论:1在本实验条件下,HF-EMF(30MHz;25-1600V/m)对女(雌)性性腺有毒性作用。具体表现在:HF-EMF可使女工月经紊乱及月经经量异常发生率增加,以及孕激素水平下降。短期暴露HF-EMF,可使雌性大鼠P4与E2水平显著增高;低剂量时会刺激卵泡发育,LH水平显著增高;高剂量时则抑制卵泡发育,LH水平显著降低;对卵巢生殖细胞超微结构影响不大。亚慢性暴露HF-EMF,E2水平显著下降和LH水平显著升高,动情前期缩短,动情间期延长,并抑制卵泡发育,促进卵泡闭锁和黄体生成,导致卵巢细胞的超微结构明显改变等一系列的毒性作用。2 HF-EMF对女(雌)性性腺有毒性作用,卵巢损害较早出现(如激素分泌功能改变)。3短期暴露HF-EMF对大鼠卵巢细胞凋亡影响不明显;亚慢性暴露HF-EMF可诱导雌性大鼠卵巢细胞凋亡;卵巢细胞凋亡存在Fas所介导的膜死亡受体途径和Bcl家族所介导的线粒体途径,但HF-EMF诱导卵巢细胞凋亡的途径可能是通过Bcl家族所介导的线粒体途径,尚不能排除高频辐射诱导其它的途径。4 SIF对亚慢性低剂量(25-400V/m)暴露HF-EMF的雌性性腺毒性有较好的保护效应,对亚慢性高剂量(1600V/m)暴露HF-EMF雌性性腺毒性的保护效应不明显。5 SIF可能是通过阻断Bcl家族所介导的线粒体途径从而抑制HF-EMF所诱导的卵巢细胞凋亡,目前尚不能排除其它的途径。