电压依赖性钾通道（Voltage-dependent potassium channels, KV）广泛分布于胃肠平滑肌细胞上，对平滑肌运动的调控起着重要的作用。根据KV的失活动力学特征可以将胃肠平滑肌上电压依赖性钾电流（KVcurrents, IKV）分为快速失活成分（fast inactivation component,IKVfast）和慢速失活成分（slow inactivation component, IKVslow）两部分。两种电流具有不同的动力学和药理学特性。他们在设定平滑肌静息膜电位（resting potential, RP）和动作电位（action potential,AP）的塑造等方面发挥重要作用。因此，当KV通道功能异常时可以导致平滑肌运动异常，但是目前有关平滑肌细胞KV通道异常与平滑肌动力障碍的研究报道甚少。肠梗阻是外科常见的急腹症之一，任何原因引起的肠内容物通过障碍均可以引起肠梗阻（obstruction）。我们的前期研究表明，在不全性机械性肠梗阻模型中不仅观察到平滑肌形态学重建，即平滑肌细胞肥大（hypertrophy）并伴有电生理特性和收缩功能的改变。因此，慢性不全性肠梗阻模型是研究平滑肌电重建（electricremodeling）与动力异常的比较理想的模型。硫化氢是最近引起广泛关注的内源性气体信号分子，在生物体内起着广泛的生理学与病理生理学作用。胃肠道组织可以产生内源性硫化氢气体，而且消化道尤其结肠内的细菌分解消化产物的过程中产生大量的外源性硫化氢。因此，消化道平滑肌处于比起其他组织都要高的硫化氢环境中，所以阐明硫化氢调控胃肠平滑肌运动及其离子通道机制有着重要的生理学及其潜在的临床意义。本文运用电生理学及分子生物学等方法，分两步研究了KV通道在胃肠平滑肌运动调控中的作用及其机制。首先，在小鼠不全性肠梗阻模型上探讨了肥大平滑肌运动障碍与电压依赖性钾通道重建的关系。在利用酶解的方法分离得到梗阻平滑肌细胞的基础上，利用全细胞膜片钳技术比较观察了新鲜分离的正常和肥大平滑肌细胞的电压依赖钾电流，重点关注了电流密度改变、对电压敏感性的改变以及对KV阻断剂TEA和4-AP敏感性的改变。利用免疫印迹和免疫组织化学方法鉴定了KV通道在平滑肌细胞膜上的表达改变，同时使用免疫沉淀技术检测了梗阻平滑肌中KV通道总的丝氨酸/苏氨酸磷酸化改变。其次探讨了外源性H2S对小鼠胃窦平滑肌的兴奋性作用及其离子通道机制。在组织水平利用离体肌条收缩实验观察H2S的兴奋性作用的基础上，在胃窦平滑肌和异源表达的H293细胞上利用全细胞膜片钳技术和膜电位染料荧光检测技术，观察了膜电流和膜电位改变，确定了H2S兴奋胃窦平滑肌的蛋白靶位点。最后使用生物素转化法检测了KV4.3的S-sulfhydration修饰情况。研究结果如下：一、小鼠肥大平滑肌细胞电压依赖性钾通道的重建1.小鼠不全性肠梗阻手术14天后，梗阻环以上的肠管明显扩张、平滑肌层明显增厚。通过胞内记录观察到，梗阻小肠平滑肌慢波幅度降低、频率减慢，静息膜电位去极化。结果提示，肠梗阻动物小肠平滑肌的形态学重建伴随平滑肌电生理特性改变，即电重建。2.利用胶原酶新鲜分离正常和梗阻小鼠小肠平滑肌细胞，镜下观察到梗阻小肠平滑肌细胞明显肥大。通过检测代表细胞表面积的细胞膜电容发现，肥大平滑肌细胞膜电容由正常的30.32±1.84pF (n=36)增加到149.37±5.74pF (n=40，p <0.05)。3.利用全细胞膜片钳技术观察了正常组、假手术组和梗阻组新鲜分离的小肠平滑肌细胞IKV。结果显示，肥大平滑肌细胞IKV电流明显大于正常的平滑肌细胞，但其电流密度明显低于正常平滑肌细胞。4.通过观察IKV激活和抑制曲线发现，IKVfast的激活曲线左移而IKVslow的激活曲线右移。正常组，假手术组和梗阻组IKVfast的V0.5act分别为-2.78±2.64mV，-4.3±3.63mV和-15.74±3.8mV（n=12,11,13, P <0.05）。正常组，假手术组和梗阻组IKVslow的V0.5act分别为-8.65±2.78mV,-8.99±3.8mV，5.14±2.61mV（n=12,11,13, P <0.05）。然而，IKVfast和IKVslow的失活曲线在正常和梗阻组之间没有显著性差异。以上结果提示，IKV电压敏感性发生了改变。5.通过观察IKV对钾通道阻断剂敏感性发现，IKVfast对电压依赖性钾通道阻断剂4-AP敏感性没有发生明显的改变。然而，对高浓度非特异性钾通道阻断剂TEA的反应有轻微的改变。梗阻组与正常组和假手术组相比，对TEA的IC50发生了轻微的减少，即15mM TEA基本阻断了梗阻细胞上的IKVslow（95.3±0.04%），而在正常和假手术组的平滑肌细胞上只阻断了55.4±0.05%和52.7±0.05%。这些结果提示，肥大平滑肌细胞IKVslow与正常平滑肌相比对TEA的敏感性提高了。6.通过形态学检测表明，梗阻组小肠平滑肌组织与正常组和假手术组相比，KV4.3和KV2.2通道表达明显增多。同时通过免疫组化膜染料双染结果显示，梗阻平滑肌细胞膜上表达的钾通道蛋白分布较其他两组增多。免疫沉淀纯化结果显示，梗阻平滑肌组织KV4.3和KV2.2磷酸化水平明显高于正常和假手术组。以上结果提示：①梗阻引起的肥大小肠平滑肌KV通道发生重建，其主要表现为梗阻引起KV通道表达明显增多但IKV密度降低、对电压和阻断剂敏感性发生改变；②这种形态学表达增多伴随电流密度降低的现象与KV通道蛋白磷酸化改变有关；③梗阻平滑肌电流密度降低与膜电位去极化有关。二、外源性H2S对小鼠胃平滑肌的兴奋作用及其离子通道机制1.我们以往的研究结果显示，低浓度（<200M）的硫化氢供体NaHS对胃平滑肌起兴奋作用。因此，本实验首先确认了100μM NaHS对离体胃平滑肌自发性收缩的影响。实验结果表明，NaHS明显增加胃平滑肌基础张力，而KV阻断剂4-AP（5mM）可以完全阻断NaHS诱导的张力增加作用。2.在强还原剂DTT（200μM）的存在下，NaHS诱导胃平滑肌张力增加的现象消失，同时NaHS诱导的的兴奋作用可以被DTT逆转，但DTT本身不影响胃平滑肌自发收缩。3.既然钾通道阻断剂4-AP能够阻断NaHS对胃平滑肌的兴奋作用，本实验在新鲜分离的胃窦平滑肌细胞上利用全细胞膜片钳技术观察了NaHS对IKV的影响。结果表明，NaHS明显抑制IKVfast，但是不影响IKVslow。蛋白巯基封闭剂NEM和DTT均可以阻断100μMNaHS对IKVfast的抑制作用。4.为了进一步证实NaHS对KV通道的作用位点，在H293细胞上异源表达KV4.1、KV4.2和KV4.3并观察了NaHS对IKV的影响。结果表明，500μM NaHS可以明显抑制去极化阶跃刺激引起的KV4.3电流，但是对KV4.1和KV4.2电流没有影响。NEM预处理细胞可以阻止NaHS对KV4.3电流的抑制作用。MTSET不能阻止NaHS的抑制作用。5. NaHS对KV通道电流的抑制作用可以使膜电位去极化，因此使用膜电位染料DiBAC4(3)检测了培养的胃窦平滑肌细胞膜电位改变。结果表明，200μM NaHS导致细胞膜电位去极化，并且NEM预处理细胞可以阻断NaHS诱导的去极化；利用siRNA技术敲减KV4.3表达也明显抑制了NaHS诱导的膜电位去极化。6最后利用生物素转化法检测了KV4.3的S-sulfhydration(硫氢化)。结果表明，H293细胞上给予500μM NaHS引起KV4.3的S-sulfhydration修饰，然而，NEM预处理细胞可以阻断KV4.3的S-sulfhydration；100μM NaHS使胃窦平滑肌组织中的KV4.3发生S-sulfhydration，而200μM DTT可以逆转KV4.3的S-sulfhydration修饰。以上结果提示：①外源性H2S通过对KV4.3进行S-sulfhydration修饰抑制了IKVfast，导致胃肠平滑肌细胞膜去极化从而发挥对胃平滑肌的兴奋性作用；②KV4.3亚基是感受外界化学刺激调控细胞膜电位的重要靶蛋白，因此干预平滑肌动力的因素可能通过KV4.3调节胃肠平滑肌细胞膜电位，调控胃肠平滑肌运动。三、小结以上两个部分的实验结果可以归纳为以下几点：1、在胃肠平滑肌电压依赖性钾通道的KV4.3亚基在平滑肌细胞膜电位调控中起着非常重要的作用；2、KV4.3亚基可能是内源性和外源性因子调控平滑肌细胞膜电位的重要靶点；3、硫化氢通过KV4.3亚基的S-sulfhydration抑制电压依赖性钾电流使膜电位去极化发挥对平滑肌的兴奋作用。