论文部分内容阅读
前言人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染人体后不同的个体呈现出不同的疾病进程，典型进展者从HIV感染进展到典型AIDS期一般需要8—10年。有研究发现大约有5％的HIV感染者病程超过10年以上，未经抗逆转录病毒治疗，CD4+T细胞仍维持正常水平，无艾滋病特征性症状，称为长期不进展者（Long-term nonprogressors，LTNPs）。国外研究发现携带有HLA-B*57或HLA-B*27的个体，不但血浆病毒载量低，而且向AIDS的进展明显延缓。而HLA-B*35等位基因在高加索人群则是疾病快速进展的危险因素。但对于中国人群HIV感染者大样本的相关研究尚未见报道。本文采用聚合酶链式反应—序列特异性引物技术（PCR-SSP），检测358例中国人群HIV感染者的HLA-B位点等位基因，探讨中国人群HIV感染疾病进程与HLA的相关性。材料和方法1、研究对象本研究以河南、吉林、辽宁、新疆、云南为主要现场，随机抽取了358例HIV阳性样本。所有标本全部由中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室经WB试验确认为阳性。相互之间均无血缘关系。LTNP组67例，入选标准为感染HIV的时间≥10年，未经抗逆转录病毒治疗，连续三次（时间间隔为3个月）CD4+T细胞测定均在500个／μl以上；TP组291例，入选标准为感染时间5-10年，入选本研究时均未经抗逆转录病毒治疗，CD4+T细胞范围在500个／μl以下。所有研究对象在抽血留样前均签署知情同意书并进行了相关问卷调查。2、试剂（1）全血细胞DNA提取试剂盒：QIAamp DNA Mini试剂盒（QIAgen，德国）（2） PCR试剂盒：TaKaRa TaqTM DR001AM（TaKaRa，日本）（3） DNA分子量标准：100bp DNA ladder（GIBCOBRL，美国）（4） HLA-Ⅰ类基因检测试剂盒：Micro SSPTM试剂盒（One Lamda，美国）3、主要仪器（1）凝胶成像分析系统：Ultra-Violet Product（UVP，英国）（2） PCR仪：GeneAmp PCR System 9600（PERKIN ELMER，美国）（3）电泳仪：POWER PAC 300（BIORAD，美国）（4）紫外分光光度计：U2001（HITACHI，日本）4、CD4绝对值计数将20μl CD4／CD8／CD3 TriTEST试剂加入CD4绝对计数管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。5、DNA提取外周血白细胞DNA的提取，使用1ml EDTA抗凝外周静脉血，采用QIAamp DNA Mini试剂盒，按照试剂盒说明书标准方法快速提取全基因组DNA 200μl。将纯化后的DNA置-20℃保存备用。6、HLA-B等位基因分型检测HLA分型采用PCR-SSP方法，PCR-SSP方法采用One Lamda公司的Micro SSPTM试剂盒。根据产物有无及片段的大小，对照Micro SSPTM HLA-Ⅰ类基因DNA分型判读卡并结合One Lambda DNA／LMT软件确定基因型。7、统计方法用SPSS11.5统计软件统计分析，HLA与疾病相关的统计学计算采用四格法计算x2，x2＞3.84者按Fisher法计算确切P值，Pc＜0.05为差异显著性判断标志。HLA与疾病进程相关程度用比值比（odds ratio，OR）计算。实验结果1、长期不进展组与典型进展组基本情况比较长期不进展组与典型进展组CD4+T细胞计数值分别为660±19个／μl和294±7个／μl，经过比较两组之间有统计学差异（P＜0.01）；两组病例检测的病毒载量值经对数转换后分别为3.39±0.13lg拷贝／ml和4.29+0.05 lg拷贝／ml，经过比较两组间亦有统计学意义（P＜0.01）。2、与HIV感染者的疾病进程相关的HLA-B位点等位基因TP组的B*15位点的等位基因频率为17.2％，而LTNP组的B*15位点的等位基因频率为8.2％，LTNP组与TP组的HLA-B*15等位基因分布的差异具有显著性（P=0.0096，OR=2.32，95％CI=1.17～4.72）。LTNP组B*67位点的等位基因频率为4.5％，而TP组的B*67位点的等位基因频率为1.2％，LTNP组的B*67位点的等位基因频率显著高于TP组（P=0.021，OR=0.26，95％CI=0.08～0.89）。结论1、HLA-B*15等位基因可能与加速中国人群HIV感染疾病进程相关；2、HLA-B*67等位基因可能与延缓中国人群HIV感染疾病进程相关。