【摘 要】
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目的:妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）是妊娠中晚期首次发现的碳水化合物不耐受的代谢性疾病,是常见的妊娠期并发症之一。随着女性肥胖的发生率增加,GDM的发病率也逐年升高。GDM的子代发生心血管风险以及代谢综合征的概率也高于正常妊娠子代,但是对于其表观遗传学机制研究主要集中于DNA甲基化,对于RNA甲基化的研究相对缺乏。因此本实验在GDM模型小鼠的基础
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金; 母胎医学重庆市重点实验室; 国家外专局111计划
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目的:妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）是妊娠中晚期首次发现的碳水化合物不耐受的代谢性疾病,是常见的妊娠期并发症之一。随着女性肥胖的发生率增加,GDM的发病率也逐年升高。GDM的子代发生心血管风险以及代谢综合征的概率也高于正常妊娠子代,但是对于其表观遗传学机制研究主要集中于DNA甲基化,对于RNA甲基化的研究相对缺乏。因此本实验在GDM模型小鼠的基础上研究了m~6A对于GDM子代代谢综合征发生的影响以及其机制。方法:通过高脂饮食（HFD）喂养建立GDM小鼠模型,并且通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、胰岛素耐量试验（ITT）对该模型的表型进行验证;部分孕鼠在孕18.5天处死并收集胎鼠肝脏组织,剩余孕鼠自然分娩,喂养子一代鼠（F1）至12周龄,并且每周测量子代鼠体重,在12周龄时通过OGTT、空腹血糖水平、空腹胰岛素水平检测葡萄糖耐量和胰岛素抵抗水平等;对孕18.5天胎鼠和12周龄子代鼠肝脏组织进行苏木素-伊红染色（HE染色）、糖原染色（PAS染色）、油红染色以及气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测肝脏组织结构以及代谢变化;检测胎鼠肝脏组织m~6A整体甲基化水平;PCR阵列筛选目的基因RNA结合蛋白15（RBM15）,Western blot检测胎鼠和12周龄鼠肝脏组织中RBM15蛋白质表达水平;胎鼠肝脏组织进行m RNA测序（m RNA-Seq）和甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序（Me RIP-Seq）;Western blot检测LO2细胞在高糖处理后RBM15的蛋白质表达水平;Dot blot检测RBM15敲降以后m~6A整体甲基化水平;葡萄糖摄取实验检测RBM15对LO2细胞胰岛素敏感性的影响;Western blot检测RBM15敲降和过表达后磷脂酸肌醇-3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt等胰岛素敏感性指标蛋白水平变化。结果:（1）HFD喂养成功建立GDM小鼠模型;GDM组12周龄F1代小鼠出现明显的葡萄糖耐量异常以及胰岛素抵抗等表型;（2）GDM组胎鼠肝脏组织m~6A整体甲基化水平升高,具有统计学差异（p＜0.05）;（3）PCR阵列分析筛选出RBM15为差异最明显的m~6A甲基化转移酶,同时GDM组孕18.5天胎鼠肝脏和12周龄F1代小鼠肝脏组织RBM15蛋白水平均明显升高,且具有统计学差异（p＜0.05）;（4）HE染色提示GDM组12周龄F1代小鼠肝脏组织肝小叶结模糊,且出现明显空泡;PAS染色提示GDM组12周龄F1代小鼠可见糖原沉积;GC-MS提示孕18.5天和12周龄子代鼠均存在部分氨基酸以及部分不饱和脂肪酸代谢异常;（5）Me RIP-Seq提示GDM组和对照组有13053个重叠峰,且m~6A差异峰主要分布在3’非翻译区域（3’UTR）;筛选既具有差异m~6A峰又具有差异m RNA表达的基因共201个,GO分析和KEGG分析发现这些差异基因主要富集于代谢相关通路;（6）在LO2细胞中敲降RBM15发现葡萄糖摄取量增加,胰岛素敏感性指标磷酸化Akt表达增加;过表达RBM15后发现葡萄糖摄取量减少,胰岛素敏感性指标磷酸化Akt表达降低。结论:相较于对照组,GDM组F1代小鼠葡萄糖耐受性更低,发生胰岛素抵抗的可能更高;与对照组相比,GDM组F1代小鼠肝脏组织代谢出现了明显的异常;GDM组子一代小鼠和对照组小鼠肝脏m~6A甲基化差异峰与差异表达基因主要富集于代谢相关通路;GDM组肝脏组织m~6A整体甲基化水平升高,并且甲基转移酶RBM15表达升高;体外实验验证RBM15可以增强胰岛素抵抗。
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