恶性肿瘤治疗后容易复发、转移,是引起肿瘤患者死亡的主要原因。提高肿瘤细胞对各种治疗手段的敏感性、延缓肿瘤的复发或转移将是提高恶性肿瘤患者生存期的重要手段。肿瘤干细胞学说认为肿瘤细胞起源于肿瘤干细胞,是正常干细胞在外界各种因素刺激下不断累积突变的结果.因此开发特异针对肿瘤干细胞的药物以及治疗方法对于恶性肿瘤的临床治疗具有重要的意义。乙醛脱氢酶1 (acetaldehyde dehydrogenase 1, ALDH1, EC 1.2.1.10)是在乙醛脱氢酶(ALDH)家族指导下合成的一类含锌酶类,参与多种分子的代谢,因而在维持正常的组织发育及内环境的稳定中发挥重要作用。ALDH1阳性表达的肿瘤细胞(ALDH1*)具有肿瘤干细胞生物学特性,包括自我更新、自我增殖、迁移和高致瘤能力。通过体外MTT生长曲线、平板克隆形成实验、肿瘤球培养、transwell实验、裸鼠成瘤实验,显示ALDH1*细胞自我更新、自我增殖、肿瘤球形成能力、迁移能力及成瘤能力明显强于未经分选的ALDH1-细胞。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)含有的酚羟基基团,是一种在中药红花中发现的效果最强的天然抗氧化物质之一,在多个方面具有很重要的药理学功效,基于其酚羟基结构和强效抗氧化能力,我们认为HSYA可能对ALDH1的活性同样具有抑制效果。在本研究中,我们结合酶动力学分析和计算机辅助模拟等方法探索HSYA与ALDH1的结合过程和相互作用。研究方法1测量不同浓度HSYA对ALDH1的酶活性影响并记录数值。2保持底物浓度不变,改变HSYA和ALDH1的浓度,测定酶活性并判断抑制类型。3保持酶的浓度不变,改变HSYA和底物的浓度,测定酶活性作双倒数图,计算抑制动力学参数。4保持底物浓度和酶浓度不变,使用不同浓度的HSYA,测定酶活性抑制效果的时间动力学过程。5测定ALDH1内源荧光和ANS结合荧光分析三级结构特征。6使用计算机模拟ALDH1三维结构,分子动力学对接预测其与HSYA的结合位点。结果1HSYA对ALDH1活力及结构的影响HSYA能够以剂量依赖方式显著抑制ALDH1的活性,导致ALDH1活力丧失达到50%(IC50)时的HSYA浓度为0.22士0.01 mM(n=3)。在不同浓度HSYA存在条件下以ALDH1的残余活力对酶浓度[E]作图,数据表明HSYA诱导的抑制效应是可逆的。Lineweaver-Burk双倒数图分析结果显示,仅有表观’max值发生了变化,说明HSYA诱导了典型的非竞争性抑制效应,并不影响底物分子与酶活性中心的结合。抑制常数Ki= 0.4238±0.2168 mM (n=3)不同浓度HSYA存在条件下对ALDH1的抑制效应的时间演化过程显示酶的催化活力变化仅在最初30秒之内的快速抑制阶段才能够观察到,在HSYA浓度从最低到最高的情况下均未随着时间演进而发生可测幅度的变化。内源荧光法发现HSYA具有淬灭剂的效果,随着HSYA浓度的逐渐增加,ALDH1的活力也被逐渐抑制,表明HSYA与ALDH1的结合和酶的活力丧失是同步发生的。淬灭的结合常数K= 45.648±0.519M-1 (n= 3),结合位点数量n=1.274±.011. ANS结合荧光分析结果显示,相较于ALDH1的初始状态,随着HSYA浓度的增加,ALDH1的疏水性也在逐步增加。这意味着疏水表面的暴露与酶结构的局部去折叠和酶活力丧失三者之间存在着关联。2 HSYA与ALDH1对接过程的计算机辅助对接和分子动力学模拟由于人源ALDH1的晶体结构未知,我们通过伪二次约束模拟退火程序(pseudo-quadratic restraint simulated annealing, PQR-SA)建立同源模型,其中与人源ALDH1最接近的模板结构为lbxs_a(来源于绵羊肝细胞质的乙醛脱氢酶)。通过分析NADH与ALDH1的模拟对接过程来发现ALDH1上可能存在的辅因子结合区域。根据分子动力学模拟的结果分析可以发现HSYA的R1和R2环结构与ALDH1之间的对接直接相关,其可能会直接插入与酶蛋白质的结合区域内。因此,我们认为HSYA能够与ALDH1的辅因子结合区域的若干氨基酸残基相结合,通过阻断NADH的生成而抑制了ALDH1的催化活力,呈现为一种非竞争性抑制效应。结论(1) HSYA能够以非竞争性抑制的模式可逆地抑制ALDH1的催化活性；(2) HSYA诱导的抑制过程是一个非常快速的过程,很难在时间演进过程中检测到比较明显的酶动力学变化；(3) HSYA与ALDH1的结合可能会促使ALDH1发生局部去折叠,并导致疏水表面暴露增加和随之而来的酶活性丧失；(4) HSYA能够与ALDH1的辅因子结合位点的若干氨基酸残基发生相互作用,其结构中的酚羟基环可能在其与酶的结合与抑制过程中起到关键作用。